目錄
前言
貢獻(xiàn)者
第1章 構(gòu)建小插入片段和大插入片段的宏基因組文庫 1
1.1 介紹 1
1.2 實(shí)驗(yàn)材料 2
1.2.1 宏基因組DNA 2
1.2.2 小片段文庫構(gòu)建 2
1.2.3 大片段文庫構(gòu)建 3
1.3 實(shí)驗(yàn)方法 4
1.3.1 小片段宏基因組文庫構(gòu)建 4
1.3.2 大片段宏基因組文庫構(gòu)建 8
1.4 注釋 10
參考文獻(xiàn) 11
第2章 從海洋過濾樣本提取總DNA與RNA及用于標(biāo)記基因研究的cDNA通用模板的制備 13
2.1 介紹 13
2.2 實(shí)驗(yàn)材料 14
2.2.1 浮游細(xì)菌樣品 14
2.2.2 DNA 與RNA同時提取 14
2.2.3 提取的DNA與RNA純化 15
2.2.4 DNA消化和PCR對照 15
2.2.5 第一鏈和第二鏈合成 16
2.3 實(shí)驗(yàn)方法 16
2.3.1 從海水濾膜樣品中同時提取DNA與RNA 16
2.3.2 純化DNA與RNA 18
2.3.3 第一鏈和第二鏈合成 20
2.4 注釋 20
參考文獻(xiàn) 21
第3章 海洋宏基因組大片段文庫的構(gòu)建與篩選 22
3.1 介紹 22
3.2 實(shí)驗(yàn)材料 23
3.2.1 取樣 23
3.2.2 宏基因組DNA的分離 24
3.2.3 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)生分析 24
3.2.4 構(gòu)建宏基因組大片段文庫 25
3.2.5 從宏基因組文庫篩選具有群體感應(yīng)抑制活性的基因 25
3.3 實(shí)驗(yàn)方法 25
3.3.1 取樣流程 25
3.3.2 宏基因組DNA分離 27
3.3.3 16S 擴(kuò)增子測序 28
3.3.4 大片段文庫構(gòu)建 29
3.3.5 采用PCR擴(kuò)增對宏基因組文庫進(jìn)行基于序列的篩選 31
3.3.6 基于功能的宏基因組文庫篩選32
3.4 注釋 35
參考文獻(xiàn) 36
第4章 寒冷和堿性極端環(huán)境宏基因組文庫的構(gòu)建與篩選 40
4.1 介紹 40
4.2 實(shí)驗(yàn)材料 42
4.2.1 完整的細(xì)胞提取和DNA提取 42
4.2.2 文庫構(gòu)建 42
4.2.3 酶活性篩選 43
4.3 實(shí)驗(yàn)方法 43
4.3.1 從伊卡巖柱樣品中獲取DNA 43
4.3.2 文庫構(gòu)建 45
4.3.3 低溫和高pH條件下酶活性的篩選 47
4.3.4 宏基因組的偏差評估及酶潛力的檢測 49
4.4 注釋 49
參考文獻(xiàn) 50
第5章 基于DNA/RNA/蛋白質(zhì)的穩(wěn)定同位素探針技術(shù)用于活性微生物標(biāo)志物的 高通量分析 52
5.1 介紹 53
5.2 實(shí)驗(yàn)材料 55
5.2.1 穩(wěn)定同位素探針技術(shù)所需的試劑和設(shè)備 55
5.2.2 核酸純化 56
5.2.3 DNA/RNA超速離心 56
5.2.4 16S rRNA基因測序 57
5.2.5 宏基因組/宏轉(zhuǎn)錄物組測序 57
5.2.6 蛋白質(zhì)純化的試劑和設(shè)備 57
5.2.7 蛋白質(zhì)膠內(nèi)消化 57
5.3 實(shí)驗(yàn)方法 58
5.3.1 被標(biāo)記的土壤和沉積物樣本的酸提取 58
5.3.2 通過氯化銫梯度離心分離同位素標(biāo)記的DNA 59
5.3.3 通過CsTFA分離同位素標(biāo)記的RNA 61
5.3.4 宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄物組分析 62
5.3.5 提取已標(biāo)記樣本中的蛋白質(zhì) 62
5.3.6 凝膠胰蛋白酶消化 63
5.3.7 利用高分辨率質(zhì)譜分析同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì) 64
5.4 注釋 65
參考文獻(xiàn) 66
第6章 植物內(nèi)生細(xì)菌和真菌的多樣性評估 68
6.1 介紹 68
6.2 實(shí)驗(yàn)材料 69
6.2.1 植物樣本采集 69
6.2.2 處理植物材料 69
6.2.3 從粉末化的植物樣本中提取DNA 70
6.2.4 標(biāo)記基因擴(kuò)增 70
6.2.5 測序數(shù)據(jù)的處理 71
6.3 實(shí)驗(yàn)方法 71
6.3.1 植物樣本采集 71
6.3.2 處理植物材料 71
6.3.3 DNA 提取 72
6.3.4 標(biāo)記基因的擴(kuò)增和測序 72
6.3.5 測序數(shù)據(jù)的處理 74
6.4 注釋 76
參考文獻(xiàn) 77
第7章 通過宏基因組鳥槍法測序技術(shù)研究復(fù)雜微生物群落中的植物軟腐病腸桿菌科病原菌 78
7.1 介紹 78
7.1.1 軟腐病腸桿菌科 78
7.1.2 分泌系統(tǒng) 79
7.1.3 基因水平轉(zhuǎn)移 79
7.1.4 宏基因組 80
7.2 實(shí)驗(yàn)材料 80
7.2.1 DNA提取 80
7.2.2 DNA富集 80
7.2.3 DNA文庫制備 80
7.2.4 實(shí)驗(yàn)室設(shè)備 80
7.2.5 軟件 81
7.3 實(shí)驗(yàn)方法 81
7.3.1 鳥槍法宏基因組測序 81
7.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和采樣 82
7.3.3 組裝前的數(shù)據(jù)預(yù)處理 84
7.3.4 物種多樣性分析 84
7.3.5 物種和功能注釋 85
7.3.6 特定的注釋工具 87
7.4 注釋 88
7.5 總結(jié) 88
參考文獻(xiàn) 89
第8章 來源于宏基因組的基因在變鉛青鏈霉菌中的克隆、表達(dá)和發(fā)酵優(yōu)化 92
8.1 介紹 92
8.2 變鉛青鏈霉菌的轉(zhuǎn)化 94
8.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 94
8.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 97
8.3 鏈霉菌載體及其特征 101
8.3.1 實(shí)驗(yàn)材料 107
8.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 109
8.4 鏈霉菌中的基因表達(dá)調(diào)控元件 112
8.4.1 實(shí)驗(yàn)材料 114
8.4.2 實(shí)驗(yàn)方法 115
8.5 采用基于pAMR4系統(tǒng)的同源重組技術(shù)將由選用的啟動子控制的目的基因整合到變鉛青鏈霉菌染色體上 118
8.5.1 實(shí)驗(yàn)材料 119
8.5.2 實(shí)驗(yàn)方法 119
8.6 重組變鉛青鏈霉菌的發(fā)酵 120
8.6.1 實(shí)驗(yàn)材料 120
8.6.2 實(shí)驗(yàn)方法 121
8.7 注釋 124
參考文獻(xiàn) 127
第9章 基于宏基因組數(shù)據(jù)的降解網(wǎng)絡(luò)重建 132
9.1 介紹 132
9.2 實(shí)驗(yàn)材料 133
9.3 實(shí)驗(yàn)方法 133
9.3.1 宏基因組序列中分解代謝基因的鑒定 133
9.3.2 創(chuàng)建降解節(jié)點(diǎn)列表 134
9.3.3 設(shè)定網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn) 136
9.3.4 添加節(jié)點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)之間的連接 136
9.3.5 設(shè)置網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的坐標(biāo) 139
9.3.6 繪制降解網(wǎng)絡(luò) 140
9.4 注釋 142
參考文獻(xiàn) 142
第10章 宏基因組DNA功能表達(dá)的新工具 144
10.1 介紹 144
10.2 實(shí)驗(yàn)材料 146
10.2.1 細(xì)菌菌株、培養(yǎng)基和抗生素 146
10.2.2 載體 148
10.2.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備：溶液和試管 150
10.2.4 用于DNA提取和純化的溶液 152
10.2.5 商業(yè)化試劑盒 153
10.2.6 酶 153
10.2.7 DNA梯狀條帶 154
10.2.8 設(shè)備和材料 154
10.3 實(shí)驗(yàn)方法 155
10.3.1 用穿梭載體pEBP18構(gòu)建宏基因組文庫 155
10.3.2 用TREX表達(dá)基因簇 161
10.3.3 穎殼伯克霍爾德菌的表達(dá) 165
10.3.4 莢膜紅細(xì)菌的表達(dá) 168
10.4 注釋 171
參考文獻(xiàn) 174
第11章 基于微孔板的活性和立體選擇性水解酶的篩選 178
11.1 介紹 178
11.2 實(shí)驗(yàn)材料 179
11.2.1 瓊脂板活性實(shí)驗(yàn)（涂平板） 179
11.2.2 微孔板培養(yǎng) 179
11.2.3 細(xì)胞裂解 180
11.2.4 酶活性測定 180
11.3 實(shí)驗(yàn)方法 181
11.3.1 瓊脂板活性測試 181
11.3.2 微孔板中酶的合成 181
11.3.3 微孔板中的細(xì)胞裂解 182
11.3.4 活性或手性選擇性的篩選 182
11.4 注釋 183
參考文獻(xiàn) 184
第12章 基于宏基因組文庫的纖維素酶的篩選 185
12.1 介紹 185
12.2 實(shí)驗(yàn)材料 187
12.2.1 無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM） 187
12.2.2 剛果紅板檢測 188
12.2.3 細(xì)胞粗萃取物的制備 188
12.2.4 DNSA檢測 188
12.2.5 纖維素酶反應(yīng)產(chǎn)物的薄層色譜分析 188
12.2.6 通過 HPLC 分析纖維素分解產(chǎn)物 189
12.3 實(shí)驗(yàn)方法 189
12.3.1 高纖維素分解微生物群落的富集 189
12.3.2 在剛果紅平板上篩選纖維素酶陽性克隆 189
12.3.3 可能陽性克隆的再轉(zhuǎn)化 190
12.3.4 具有纖維素分解活性克隆的細(xì)胞粗萃取物的制備 190
12.3.5 纖維素酶活性的分析 190
12.4 注釋 194
參考文獻(xiàn) 194
第13章 利用對硝基苯基底物篩選宏基因組文庫中輔助性木質(zhì)纖維素酶的 液相復(fù)用高通量篩選技術(shù) 197
13.1 介紹 197
13.2 實(shí)驗(yàn)材料 199
13.2.1 克隆文庫培養(yǎng)與表達(dá) 199
13.2.2 對硝基苯基底物液相檢測 199
13.3 實(shí)驗(yàn)方法 200
13.3.1 克隆文庫的疊加復(fù)用 200
13.3.2 液相pNP檢測 201
13.3.3 鑒定含有目標(biāo)酶的克隆 202
13.4 注釋 202
參考文獻(xiàn) 204
第14章 修飾多酚類底物的糖基轉(zhuǎn)移酶的篩選 206
14.1 介紹 206
14.2 實(shí)驗(yàn)材料 207
14.2.1 生物轉(zhuǎn)化形成反應(yīng) 207
14.2.2 利用薄層色譜對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析 208
14.3 實(shí)驗(yàn)方法 208
14.3.1 宏基因組克隆文庫的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng) 208
14.3.2 準(zhǔn)備宏基因組樣品以供TLC分析 209
14.3.3 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的TLC分析 209
14.3.4 酶檢測 210
14.4 注釋 211
參考文獻(xiàn) 212
第15章 從復(fù)雜微生物群落中分離編碼新型PHA代謝酶基因的方法 213
15.1 介紹 213
15.2 實(shí)驗(yàn)材料 215
15.2.1 細(xì)菌生長培養(yǎng)基 215
15.2.2 分子生物學(xué)試劑 216
15.3 實(shí)驗(yàn)方法 216
15.3.1 細(xì)菌生長和儲存條件 216
15.3.2 土壤宏基因組文庫的構(gòu)建 217
15.3.3 利用三親本接合法將宏基因組文庫轉(zhuǎn)移到苜蓿中華根瘤菌和惡臭假單胞菌中 217
15.3.4 轉(zhuǎn)移來自苜蓿中華根瘤菌或惡臭假單胞菌假定的互補(bǔ)克隆至大腸桿菌中 217
15.3.5 遺傳分子生物學(xué) 218
15.3.6 PHA積累 218
15.3.7 PHA合成克隆宏基因組文庫的篩選 219
15.3.8 利用營養(yǎng)缺陷從宏基因組文庫中分離PHB循環(huán)基因 220
15.4 注釋 221
參考文獻(xiàn) 222
第16章 基于功能宏基因組文庫的磷酸酶活性編碼基因的篩選和異源表達(dá) 224
16.1 介紹 224
16.2 實(shí)驗(yàn)材料 225
16.2.1 基于功能宏基因組文庫篩選鑒定磷酸酶基因 225
16.2.2 磷酸酶基因的異源表達(dá) 226
16.3 實(shí)驗(yàn)方法 227
16.3.1 通過基于功能宏基因組文庫的篩選鑒定磷酸酶基因 227
16.3.2 磷酸酶基因的有效異源表達(dá) 229
16.4 注釋 232
考文獻(xiàn) 233
第17章 基于活性宏基因組文庫的氫化酶篩選 235
17.1 介紹 235
17.2 實(shí)驗(yàn)材料 236
17.2.1 實(shí)驗(yàn)室儀器 236
17.2.2 菌株、質(zhì)粒和生長培養(yǎng)基 236
17.2.3 試劑盒和（限制性內(nèi)切）酶 237
17.3 實(shí)驗(yàn)方法 237
17.3.1 宏基因組文庫構(gòu)建及其與廣泛宿主載體pRS44連接 238
17.3.2 宏基因組文庫中吸氫活性基因的篩選 239
17.4 注釋 242
參考文獻(xiàn) 242
第18章 基于N-AHSL信號的干擾酶篩選 244
18.1 介紹 244
18.2 實(shí)驗(yàn)材料 246
18.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)的菌株和生長介質(zhì) 246
18.2.2 N-AHSL降解實(shí)驗(yàn) 246
18.2.3 薄層色譜法 247
18.2.4 HPLC 247
18.3 實(shí)驗(yàn)方法 248
18.3.1 用于N-AHSL降解實(shí)驗(yàn)的RC和CCE的制備 248
18.3.2 微孔板快速篩選N-AHSL降解單克隆或混合克隆池 249
18.3.3 N-AHSL內(nèi)酯酶和�；�轉(zhuǎn)移酶活性篩選/N-AHSL降解驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 251
18.3.4 HPLC-MS鑒定N-AHSL內(nèi)酯酶的活性 254
18.3.5 HPLC檢測N-AHSL�；�轉(zhuǎn)移酶的活性 254
18.4 注釋 255
參考文獻(xiàn) 257
第19章 挖掘微生物信號分子助力次級代謝產(chǎn)物的生物探索 259
19.1 介紹 259
19.2 實(shí)驗(yàn)材料 260
19.2.1 培養(yǎng)基配方 261
19.2.2 群體感應(yīng)生物傳感器菌株 261
19.2.3 高通量自動化篩選平臺 261
19.2.4 QS信號分子的驗(yàn)證 262
19.2.5 HPLC-MS分析AHL和AHQ化合物的特征 262
19.2.6 在致病菌系統(tǒng)中驗(yàn)證QS活性 263
19.3 實(shí)驗(yàn)方法 263
19.3.1 從宏基因組文庫中篩選 QS 活性克隆 263
19.3.2 QS 活性物質(zhì)的提取和驗(yàn)證 265
19.3.3 HPLC鑒定QS活性化合物 267
19.3.4 在模式致病菌系統(tǒng)中實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AHL化合物 268
19.4 注釋 269
參考文獻(xiàn) 270