基因工程技術是現代生物技術的集中體現，該技術自誕生以來取得的杰出成就深刻影響和促進了生命科學的發(fā)展和人類社會的進步�；蚬こ滩粌H是生物技術專業(yè)和生物工程專業(yè)的主要專業(yè)課，也是生物科學專業(yè)必須學習和掌握的基本理論知識和基本研究技能之一，因此該課程在所有相關學科中占有重要地位。常重杰主編的《基因工程》本著“重視基礎、拓展眼界、聯系實際”的原則，對基因工程的基本概念和重要研究技術原理進行了系統、翔實的介紹。同時，部分內容結合教學實踐需要，介紹了該學科最新進展，并提供了重要文獻和進一步閱讀指南。
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《生命科學核心課程系列教材:基因工程》本著“重視基礎、拓展眼界、聯系實際”的原則，對基因工程的基本概念和重要研究技術原理進行了系統、翔實的介紹。同時，部分內容結合教學實踐需要，介紹了該學科最新進展，并提供了重要文獻和進一步閱讀指南。
《生命科學核心課程系列教材:基因工程》可作為師范院校、綜合性大學、農林院校相關專業(yè)本科生教材，同時也可作為相關專業(yè)研究生和科技工作者的參考用書。
目錄
前言
第1章 緒論 1
1.1 基因工程的基本概念 1
1.2 基因工程的研究內容 2
1.3 基因工程誕生的基礎 2
1.3.1 基因工程誕生的理論基礎 2
1.3.2 技術上的三大突破 3
1.4 基因工程技術的誕生 3
1.5 基因工程的應用 5
1.5.1 原核細胞基因工程 5
1.5.2 植物基因工程 7
1.5.3 動物基因工程 8
1.5.4 基因治療 8
1.5.5 理論研究 9
1.6 基因工程的安全性 9
1.7 我國的《基因工程安全管理辦法》 11
思考題 12
參考文獻 13
第2章 基因工程的基本技術 14
2.1 凝膠電泳技術 14
2.1.1 基本原理 15
2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳 15
2.1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 17
2.1.4 脈沖場凝膠電泳 18
2.1.5 雙向電泳技術 20
2.1.6 凝膠電泳片段的回收與純化 21
2.2 分子雜交技術 22
2.2.1 分子雜交的原理 22
2.2.2 分子雜交的類型 24
2.3 PCR技術 26
2.3.1 PCR基本原理和反應過程 26
2.3.2 PCR反應的體系及其設計和優(yōu)化 28
2.3.3 PCR產物的克隆 31
2.3.4 PCR技術的發(fā)展及其應用 36
2.4 DNA序列分析 47
2.4.1 Maxam Gibert化學降解法 47
2.4.2 Sanger雙脫氧鏈終止法 49
2.4.3 DNA序列分析的自動化 50
2.4.4 DNA序列的生物信息學分析 52
2.5 基因芯片及數據分析 53
2.5.1 基因芯片概念 54
2.5.2 技術原理 54
2.5.3 基因芯片的制備 54
2.5.4 基因芯片的應用 55
2.6 研究蛋白質與DNA相互作用的主要方法 57
2.6.1 酵母單雜交系統（可延伸雙雜交） 57
2.6.2 凝膠阻滯試驗（Gel shift） 57
2.6.3 DNase工足跡法 58
2.6.4 噬菌體展示技術 58
思考題 59
參考文獻 59
第3章 基因工程的工具酶 61
3.1 限制性內切核酸酶 62
3.1.1 限制性內切核酸酶的發(fā)現與種類 62
3.1.2 限制性內切核酸酶的命名 63
3.1.3 Ⅱ型限制性內切核酸酶的基本特性 63
3.1.4 影響限制性內切核酸酶活性的因素 66
3.1.5 限制性內切核酸酶酶切DNA的方法 68
3.2 DNA連接酶 68
3.2.1 DNA連接酶的發(fā)現 68
3.2.2 DNA連接酶的種類 69
3.2.3 黏性末端DNA片段的連接 69
3.2.4 平末端DNA片段的連接 71
3.2.5 影響連接反應的因素 73
3.3 DNA聚合酶和反轉錄酶 74
3.3.1 大腸桿菌DNA聚合酶工及其應用 75
3.3.2 E.coli DNA聚合酶工的Klenow大片段酶及其應用 76
3.3.3 T4噬菌體DNA聚合酶 77
3.3.4 T，噬菌體DNA聚合酶與測序酶 77
3.3.5 反轉錄酶 78
3.4 修飾酶類 79
3.4.1 末端脫氧核苷酸轉移酶 79
3.4.2 T4多核苷酸激酶 79
3.4.3 堿性磷酸酶 79
3.5 其他工具酶 80
3.5.1 S1核酸酶 80
3.5.2 Bal 31核酸酶 81
3.5.3 核酸外切酶 82
3.5.4 RNA酶 83
思考題 84
參考文獻 84
第4章 基因工程的克隆載體 85
4.1 質粒載體 86
4.1.1 質粒的一般生物學特性 86
4.1.2 質粒DNA的復制與拷貝數的控制 89
4.1.3 質粒DNA的分離與純化 91
4.1.4 質粒載體的構建及類型 92
4.1.5 重要的大腸桿菌質粒載體 95
4.1.6 質粒載體的穩(wěn)定性問題 99
4.2 噬菌體載體 100
4.2.1 噬菌體的一般生物學特性 100
4.2.2 入噬菌體載體 103
4.2.3 單鏈DNA噬菌體載體 107
4.3 柯斯質粒載體 112
4.3.1 柯斯質粒載體的構建及其特點 112
4.3.2 柯斯克隆 113
4.3.3 柯斯克隆的改良 114
4.4 噬菌粒載體 116
4.4.1 噬菌粒載體的概念 116
4.4.2 pUC118和pUC119噬菌粒載體 117
4.4.3 pBluescript噬菌粒載體 118
4.5 人工染色體克隆載體 119
4.5.1 構建大容量載體的必要性 119
4.5.2 人工染色體的必需成分 120
4.5.3 酵母人工染色體載體 120
4.5.4 細菌人工染色體載體 122
4.5.5 Pl人工染色體 123
4.5.6 人類人工染色體 123
4.5.7 植物人工染色體 124
思考題 124
參考文獻 125
第5章 目的基因的獲取與改造 126
5.1 DNA的人工合成 126
5.1.1 人工合成DNA的原理 126
5.1.2 人工合成DNA的應用 128
5.2 從基因文庫獲取目的基因 130
5.2.1 基因組文庫的構建與篩選 130
5.2.2 cDNA文庫的構建與篩選 136
5.2.3 基因組文庫與cDNA文庫的區(qū)別 140
5.3 PCR技術與目的基因的分離 141
5.3.1 目的基因的直接擴增和克隆 141
5.3.2 目的基因的cDNA的克隆 141
5.4 電子克隆獲取目的基因 141
5.4.1 電子克隆的基本原理 142
5.4.2 利用EST數據庫進行電子克隆 142
5.4.3 利用基因組數據庫進行電子克隆 143
5.4.4 全長cDNA的判斷 143
5.5 根據基因差異表達獲得目的基因 143
5.5.1 mRNA差異顯示技術． 143
5.5.2 cDNA代表性差異分析 145
5.5.3 抑制差減雜交技術 145
5.6 目的基因的改造 147
5.6.1 基因突變與人工誘變技術 147
5.6.2 基因走點誘變 149
5.6.3 基因隨機突變 151
思考題 153
參考文獻 153
第6章 目的基因的導入與重組體的鑒定 155
6.1 重組DNA向原核細胞的導入． 155
6.1.1 原核受體細胞的種類及特點 155
6.1.2 轉化 156
6.1.3 重組質粒DNA分子轉化大腸桿菌 157
6.1.4 重組入噬菌體DNA分子轉導大腸桿菌 160
6.2 重組DNA導入真核細胞 16l
6.2.1 真核受體細胞 161
6.2.2 重組DNA分子導入酵母細胞 162
6.2.3 重組DNA分子導入植物細胞 162
6.2.4 重組DNA分子導入哺乳動物細胞 164
6.3 重組體克隆的篩選與鑒定 167
6.3.1 載體遺傳標記篩選法 167
6.3.2 依賴于重組子結構特征分析的篩選法 171
6.3.3 核酸分子雜交檢測法 172
6.3.4 免疫化學檢測法 174
6.3.5 翻譯篩選法 175
6.3.6 亞克隆法 176
6.3.7 插入失活法 176
6.3.8 電子顯微鏡作圖檢測法 177
6.3.9 轉錄產物作圖 177
6.3.10 基因表達產物分析法 177
6.3.11 DNA序列測定法 178
思考題 179
參考文獻 179
第7章 外源基因的原核表達系統 180
7.1 原核表達系統的特點 180
7.1.1 原核生物的轉錄 180
7.1.2 原核生物的翻譯 181
7.2 原核細胞表達體系 182
7.2.1 大腸桿菌表達體系 182
7.2.2 芽孢桿菌表達體系 185
7.2.3 鏈霉菌表達體系 186
7.2.4 藍藻表達體系 188
7.3 提高外源基因表達水平的措施 190
7.3.1 優(yōu)化表達載體的設計 190
7.3.2 避免使用稀有密碼子 190
7.3.3 提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性 190
7.3.4 提高表達蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解 191
7.3.5 減輕細脆的代謝負荷，提高外源基因的表達水平 191
7.3.6 優(yōu)化發(fā)酵條件 191
7.4 利用原核細胞生產真核蛋白質的實例 191
7.4.1 干擾素基因工程 191
7.4.2 生長激素基因工程 192
7.4.3 生長激素釋放抑制因子基因工程 193
7.4.4 胰島素基因工程 194
7.4.5 α-淀粉酶基因工程 195
7.5 目的蛋白的純化 197
7.5.1 組氨酸標簽 197
7.5.2 GST 標簽 198
7.5.3 MBP標簽 199
7.5.4 IMPACT 199
7.5.5 TAP 標簽 200
思考題 201
參考文獻 20l
第8章 外源基因的真核表達系統 202
8.1 真核細胞表達體系的特點 202
8.1.1 利用真核細胞作宿主系統的優(yōu)點 202
8.2 酵母表達系統 203
8.2.1 酵母基因表達載體的構成 203
8.2.2 酵母基因表達載體的種類 204
8.2.3 酵母基因表達系統宿主菌 207
8.2.4 在酵母中高效表達外源基因的策略 207
8.3 昆蟲或昆蟲細胞表達體系 208
8.3.1 以重組桿狀病毒為載體的昆蟲表達體系 209
8.3.2 桿狀病毒表達系統的效率與加工能力 209
8.3.3 一類穩(wěn)定轉化的昆蟲表達系統 211
8.4 哺乳動物細胞基因表達系統 212
8.4.1 哺乳動物基因表達載體的組成特征 213
8.4.2 哺乳動物基因表達載體 214
8.4.3 哺乳動物基因表達宿主細胞 220
8.4.4 提高哺乳動物基因表達系統表達效率的因素 221
思考題 221
參考文獻 222
第9章 轉基因動物 223
9.1 轉基因動物發(fā)展簡史 223
9.2 轉基因動物技術 225
9.2.1 外源基因導入動物細胞的方法 225
9.2.2 轉基因動物技術的新發(fā)展 234
9.3 轉基因動物的制備和檢測 240
9.3.1 以顯微注射小鼠為例介紹轉基因動物的制備 240
9.3.2 轉基因的鑒定和表達水平檢測 241
9.4 轉基因動物研究中出現的問題及其對策 243
9.4.1 轉基因動物效率極低 243
9.4.2 難以控制轉基因在寄主基因組的行為 244
9.4.3 大部分轉基因表達水平極低 244
9.4.4 轉基因表達特征及提高轉基因表達的策略 245
9.5 轉基因動物的應用 246
9.5.1 在生產和生活中的應用 246
9.5.2 在生物制藥方面的應用——動物生物反應器 247
9.5.3 在疾病研究中的應用 249
9.5.4 在基礎研究中的應用 250
9.6 轉基因動物的安全性及其未來 250
9.6.1 食品安全性 251
9.6.2 環(huán)境安全性 25l
思考題 252
參考文獻 252
第10章 轉基因植物 254
10.1 轉基因植物概述 254
10.2 轉基因植物的基因轉化方法 255
10.2.1 轉基因植物受體系統 255
10.2.2 農桿菌介導的植物基因轉化技術 256
10.2.3 DNA直接導入的基因轉化技術 262
10.2.4 花粉管通道法介導的基因轉化技術 264
10.3 轉基因植物的檢測方法 265
10.3.1 基于報告基因／選擇標記基因的轉基因植物檢測方法 265
10.3.2 基于報告基因的轉基因植物的外源基因表達檢測 266
10.3.3 外源目的基因整合的鑒定 267
10.4 抗蟲轉基因植物 268
10.4.1 來源于微生物的抗蟲基因 268
10.4.2 來源于植物的抗蟲基因的應用 270
10.5 抗細菌轉基因作物 272
10.5.1 裂解細菌細胞壁 272
10.5.2 破壞細菌細胞膜 273
10.5.3 解除細菌毒素的毒性作用 274
10.5.4 引入對細菌毒素不敏感的靶酶 274
10.5.5 增強植物本身的防衛(wèi)蛋白合成 274
10.6 抗病毒轉基因作物 275
10.6.1 利用非病毒來源的抗病毒基因策略 275
10.6.2 利用病毒來源基因的抗病毒策略 276
10.7 抗除草劑轉基因作物 279
10.7.1 增加靶標酶或靶標蛋白的拷貝數 279
10.7.2 作用靶標酶的修飾 279
10.7.3 分離能解除除草劑毒性的酶基因 280
10.7.4 新型除草劑的發(fā)展方向 280
10.8 抗逆境轉基因作物 280
10.8.1 抗干旱脅迫策略 280
10.8.2 抗寒凍脅迫策略 281
10.8.3 抗鹽堿脅迫策略 282
10.9植物生物反應器 282
10.9.1 植物生物反應器的優(yōu)點 282
10.9.2 植物生物反應器的研究現狀 283
10.9.3 植物生物反應器存在的問題 283
10.10 轉基因沉默的原因及對策 284
10.10.1 轉基因沉默的原因 284
10.10.2 控制轉基因沉默的策略 285
10.11 轉基因植物的安全性評價 285
10.11.1 轉基因植物食品的安全性評價 286
10.11.2 轉基因植物生態(tài)環(huán)境的安全性評價 288
思考題 290
參考文獻 290
第11章 基因治療 291
11.1 基因治療的基本概念 291
11.2 基因治療的發(fā)展簡史與現狀 291
11.3 基因治療的策略 294
11.3.1 根據基因導入體內的方式 294
11.3.2 根據導入基因發(fā)生作用的方式 295
11.4 基因治療的流程 295
11.4.1 目的基因的準備 295
11.4.2 靶細胞 295
11.4.3 載體的選擇 295
11.4.4 轉移技術 296
11.5 基因治療的應用 304
11.5.1 腫瘤的基因治療 305
11.5.2 單基因病的基因治療 312
11.5.3 艾滋病等感染性疾病的基因治療 315
11.6 基因治療的前景 316
11.6.1 基因治療面臨的問題和挑戰(zhàn) 316
11.6.2 基因治療的發(fā)展方向 317
思考題 317
參考文獻 317
第12章 合成生物學與基因工程 319
12.1 合成生物學 319
12.1.1 合成生物學的定義 319
12.1.2 合成生物學的研究內容 320
12.1.3 合成生物學的工程本質 325
12.1.4 合成生物學的意義 327
12.1.5 合成生物學的應用 328
12.2 合成生物學與基因工程 331
12.2.1 合成生物學與基因工程的差異 332
12.2.2 合成生物學與基因工程相似之處 333
思考題 334
參考文獻 334
附錄 總復習題 335
在實際應用方面，生物芯片技術可廣泛應用于疾病診斷和治療、藥物篩選、農作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測、國防、航天等許多領域。在疾病診斷方面，由博奧生物有限公司研發(fā)的多重等位基因特異性PCR通用芯片（allele—specific PCR—baseduniversal array，ASPUA），可在5h之內完成導致遺傳性耳聾的4種常見基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體基因）的檢測；我國軍事醫(yī)學科學院已先后研制出快速檢測甲型H1N1流感病毒檢測基因芯片以及專門針對甲型H1N1流感病毒抗藥性的基因確診和耐藥性分析的基因芯片等。在司法方面，便攜式DNA芯片檢測裝置可以直接在犯罪現場對可能是疑犯留下來的頭發(fā)、唾液、精液等進行分析，并立刻與DNA罪犯指紋庫系統存蓄的DNA“指紋”進行比較，進行快速準確地破案。在藥物篩選方面，博奧生物芯片有限公司研發(fā)的“超高通量藥物篩選芯片”每小時能做380個細胞分析，而一個科研人員一天最多只能分析五六個細胞，這意味著藥物研發(fā)效率的飛躍，同時新藥物研發(fā)費用也大大降低。在農林方面，目前已利用基因表達譜芯片進行了植物激素的中心作用、植物基因與環(huán)境的相互影響、多種因素（肥力、種子、環(huán)境耐受力和抗蟲害等）與植物基因表達的關系的研究，最終有可能用生物芯片技術取代現在沿用的費時費錢的大田試驗模式。在食品安全方面，世界上第一個能夠檢測肉類中獸藥殘留的生物芯片系統在北京國家工程研究中心研制成功，該芯片能夠分析大量的生物分子，快速準確地完成肉類中獸藥殘留的檢測工作。目前，美國國立環(huán)境衛(wèi)生研究院已開發(fā)出檢測環(huán)境有毒物的毒理芯片去評估未知化合物或混合物的潛在危害。在國防方面，生物戰(zhàn)劑與化學戰(zhàn)劑的偵檢是一項很復雜且又十分重要的工作，可以采用基因芯片技術檢測細菌、病毒、支原體、衣原體、立克次氏體等微生物；隨著許多威脅人類健康的疾病基因、各種與體能有關基因及機體對特殊環(huán)境的適應基因的陸續(xù)發(fā)現，使得分子選兵成為可能，生物芯片將廣泛用于分子選兵，尤其是對特種士兵的篩選以及軍人體能評價等領域。
總之，隨著大規(guī)模基因組測序的完成，生物學家開始從相對靜態(tài)的基因組研究轉向更為動態(tài)的基因表達過程研究。通過對不同細胞類型之間表達模式差異的研究，可以從動態(tài)的角度刻畫出一幅生命活動的“動畫”，來進一步探索生命的奧秘。在這一過程中，芯片技術展現出巨大的應用前景�；蛐酒瑢槿祟愓J識生命的起源、遺傳、發(fā)育與進化，為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設計和藥物開發(fā)中先導化合物的快速篩選和藥物基因組學研究提供技術支撐平臺。
2.6 研究蛋白質與DNA相互作用的主要方法
DNA—蛋白質相互作用的研究是21世紀生命科學研究的主要課題之一，涉及了多學科前沿交叉領域里的相關知識和技術方法。弄清DNA—蛋白質相互作用的機制，對我們了解DNA轉錄調控和基因表達機制，揭示各種生命活動現象具有極其重要的指導作用。研究DNA蛋白質相互作用的實驗方法主要包括凝膠阻滯實驗、酵母單雜交體系、DNase Ⅰ足跡實驗、噬菌體展示技術和熒光技術等。
2.6.1酵母單雜交系統（可延伸雙雜交）
該技術是由J.J.Li和I.Herskowitz從酵母雙雜交技術發(fā)展來的。它通過對酵母細胞內報告基因表達狀況的分析，來鑒定DNA順式作用元件和轉錄因子的結合情況；通過篩選DNA文庫來獲得與靶序列特異結合的蛋白質基因序列。它的原理（圖2—28）是：根據大多數轉錄因子含有DNA結合結構域（DNA—binding domain，BD）和轉錄激活結構域（activation domain，AD），且兩結構域可完全獨立地發(fā)揮作用的特點，來設計攜帶有編碼“靶蛋白”的文庫質粒，從而使文庫蛋白編碼基因置換酵母原有轉錄因子CAL4的DNA結合結構域，并通過表達的“靶蛋白”與目的基因相互作用來激活RNA聚合酶，啟動下游報告基因的轉錄。由此可見，該系統需包含：①將文庫蛋白的編碼基因與轉錄激活域融合表達的cDNA文庫質粒；②含目的基因與下游報告基因的報告質粒。其中，文庫的設計和篩選實驗是整個酵母單雜交系統的核心技術。
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