《氧化應(yīng)激狀態(tài)下維持黑素小體蛋白低免疫原性 的分子機(jī)制研究》：研究背景及目的： 黑素為一組單體吲哚分子（DHI－優(yōu)黑素和DHI（ ：A．優(yōu)黑素），通 過共價鍵連接，并與醌和蛋白質(zhì)高度聚合而形成的一 種異質(zhì)性聚合 物（heterogeneouscopolymers）。這兩種吲哚分子 能以不同比例相互 交聯(lián)（cmss—linked），在共聚合過程中形成π－堆 疊（π－staeked）層狀 的大分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。在黑素生成過程中，多個黑素生 成蛋白參與對 黑素生成代謝的調(diào)控，共同影響著黑素生成的質(zhì)與量 。其中，Tyr 可催化L－酪氨酸羥化生成L－多巴和L一多巴氧化生 成L－多巴醌，為 黑素生成的限速酶。另一個重要的調(diào)節(jié)靶點是Dct催 化多巴色素異 構(gòu)重排生成5，6一二羥基吲哚羧酸（DHIC1A），然而 DHICA自身并 不能發(fā)生聚合，只有在DHI’和Tyr存在時，DHICA才 被摻人到黑 素聚合物中，否則多巴色素快速自發(fā)脫羧生成5，6一 二羥基吲哚 （DHI）和大量ROs。已有研究證實，三種黑素生成蛋 白（Tyr、 Tyrpl和Dct）在黑素小體內(nèi)組成一多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)， 目的是提高黑 素生化合成效率，維持酶蛋白自身的穩(wěn)定和最大限度 減少中間產(chǎn)物 的細(xì)胞毒性。
     在多酶復(fù)合體中，Det被認(rèn)為是一種原位實時氧 化應(yīng)激清除劑 （reahimescavenger），它能瞬時清除中間產(chǎn)物所誘 生的活性氧基， 通過調(diào)節(jié)DHI／DHICA比例，動態(tài)影響著黑素生成和吲 哚分子的生 物聚合速率，從而調(diào)整黑素細(xì)胞對uVR的防護(hù)能力， 最終使皮膚 黑素生成增加。此外在黑素生化反應(yīng)過程中，黑素小 體內(nèi)部近似于 封閉的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是黑素細(xì)胞最大程度地減少黑素前 體物質(zhì)細(xì)胞毒 性的一種防護(hù)策略。黑素小體蛋白極有可能被包被于 黑素小體的各 個球形實體的內(nèi)核中，形成“盾樣”屏障結(jié)構(gòu)，以保 護(hù)蛋白免遭氧 化攻擊。與此同時，黑素細(xì)胞還擁有強(qiáng)大的酶和非酶 抗氧化防護(hù)機(jī) 制（如谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、Fenton反 應(yīng)等），以瞬 時清除中間產(chǎn)物誘生的活性氧基，使黑素細(xì)胞和黑素 小體蛋白免遭 損傷。然而，對黑素小體蛋白與黑素聚合物之間的相 互作用及其在 高和或持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，是如何免遭氧化應(yīng)激 損傷，以維持 其低免疫原性的機(jī)制仍知之甚少。
     體內(nèi)外研究已證實過氧化氫（H202）在白癜風(fēng)患 者表皮內(nèi)大量 堆積，甚至高達(dá)毫摩爾濃度。且在白癜風(fēng)患者進(jìn)展期 皮損和／或血 清中，已檢測到的多種抗黑素小體蛋白的自身抗體和 T淋巴細(xì)胞 表達(dá)異常。功能性的黑素細(xì)胞障礙或缺失被認(rèn)為是黑 素小體蛋白自 身反應(yīng)T細(xì)胞或自身抗體介導(dǎo)的一種免疫反應(yīng)。然而 ，白癜風(fēng)黑 素細(xì)胞Dct基因的功能調(diào)節(jié)失調(diào)和分子損傷機(jī)制是如 何發(fā)生的，免 疫系統(tǒng)是如何識別這些黑素小體內(nèi)膜上隱蔽的抗原表 位肽，黑素小 體蛋白免疫耐受的狀態(tài)又是如何遭到破壞的，至今仍 未清楚。新近 研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度H2O2作用下，甲狀腺球蛋白可 發(fā)生斷裂， 生成具有免疫反應(yīng)性的多肽，這些多肽還能被橋本氏 甲狀腺炎病人 血清中抗甲狀腺球蛋白自身抗體所識別。因此我們推 測，激發(fā)對黑 素細(xì)胞的免疫破壞的始動因素可能為：（1）白癜風(fēng) 黑素細(xì)胞很可能 在清除黑素生成中間產(chǎn)物及活性氧基方面存在一定缺 陷，大量生成 的活性氧基分子（尤其是H202）可對已發(fā)生聚合的黑 素進(jìn)行高強(qiáng)度 的攻擊，導(dǎo)致黑素聚合物中吲哚單位發(fā)生氧化斷裂， 使內(nèi)部隱蔽的 抗原表位肽暴露；（2）與吲哚單位相連的黑素小體 蛋白發(fā)生斷裂， 生成具有免疫反應(yīng)性的多肽如未能即使清除，則氧化 修飾后的蛋白 片段可能成為半抗原，具有強(qiáng)的免疫原性；（3）多 巴色素異構(gòu)酶 （Dct）滅活使DHJCA／DHI吲哚單位遭到破壞，喪失 其抗氧化能力， 甚至可能會表現(xiàn)為促氧化作用。
     體內(nèi)直接研究Dot調(diào)控的氧化應(yīng)激改變對黑素小 體蛋白免疫原 性影響的早期上游事件十分困難，部分原因是由于 Dct在黑素小體 內(nèi)與其他黑素生成蛋白密切結(jié)合形成多酶復(fù)合物結(jié)構(gòu) 。因此在本研 究中，我們應(yīng)用蔗糖梯度離心法從Dct突變slatyrMC （第194位精氨 酸被谷氨酰胺置換，R194Q）和野生型melan－aMc分 離不同時期的 黑素小體蛋白，并將這些蛋白免疫小鼠的后腳墊，體 內(nèi)測定這兩種 黑素細(xì)胞衍生的黑素小體蛋白的免疫原性以及不同氧 化應(yīng)激狀態(tài)對 其免疫原性的影響，以期揭示白癜風(fēng)黑素細(xì)胞黑素小 體膜上的這些 自身蛋白抗原免疫耐受狀態(tài)破壞的分子機(jī)制和激發(fā)抗 黑素細(xì)胞自身 免疫反應(yīng)的始動事件。
     劉小明專著的《氧化應(yīng)激狀態(tài)下維持黑素小體蛋 白低免疫原性的分子機(jī)制研究》：研究方法與結(jié)果： 1）．Dct突變slatyMc和野生型n5elanIaMc內(nèi)黑 素生成相關(guān)蛋白 酶活性及ROS水平測定：分光光度計法測定Dct突變 slatyMC和 野生型melan－aMC內(nèi)Tyr（主要是多巴氧化酶）、Dct 和過氧化氫酶 活力。二氯熒光素（H2DCF－DA）標(biāo)記法測定兩種MC 在經(jīng)100 μmol／LH2O2處理前后胞內(nèi)ROs水平的變化。結(jié)果顯 示；與melan． aMc相比，slatyMcDct酶活力明顯減低，而Tyr、過氧 化氫酶活 性在兩組MC之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞O．05）。細(xì) 胞內(nèi)ROS水平 測定結(jié)果顯示，H202處理前，slatyMC和melan－aMC 胞內(nèi)的ROS 相對熒光強(qiáng)度分別為6．33±0．17和5．42±O．14， 但處理后，slaty Mc胞內(nèi)的ROS相對熒光強(qiáng)度（18．29±0．34）急劇增 加，與mehin．a(chǎn) MC（9．14±0．28）相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜O．05）。
     2）蔗糖梯度離心分離Dct突變slatyMC和野生型 melan—aMc 黑素小體超微結(jié)構(gòu)及其蛋白表達(dá)水平測定：將Dct突 變slatyMc和 野生型melan—aMc分別用0．25％胰酶／0．02％EDTA 消化，收獲細(xì) 胞后將細(xì)胞團(tuán)塊勻漿，蔗糖梯度離心分離黑素小體。
    蔗糖濃度梯度 分別為1．0、1．2、1．4、1．5、16、1．8和2． 0moL／L．取1．0～ 1．2moL／L和1．6—1．8mol／L梯度界面行透射電子 顯微鏡（TEM）觀 察黑素小體發(fā)育與成熟。分光光度計法和 WesternBlot蛋白印跡技 術(shù)測定蔗糖梯度離心片段三種酪氨酸酶家族蛋白酶活 性和蛋白表達(dá) 水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種MC勻漿團(tuán)塊顏色分別為棕褐色 和奶黃色。
    蔗糖梯度離心后，可見離心條帶分別位于1．0、1．2 、1．4、1．6、1．8 和2．0moL／L蔗糖界面上層。透射電子顯微鏡觀察發(fā) 現(xiàn)，1．2～ 1．4mol／L層蔗糖片段主要富含呈球形或卵圓形的I ．II期黑素小體 （早期黑素小體），1．6～l8mol，／L層蔗糖片段主 要富含以黑素沉積 在纖維狀橫嵴上為主的III—IV期黑素小體（晚期黑 素小體），與離心 分離的melan—aMc1．6～1．8mol／L層蔗糖片段相比 ，slatyMC 1．6～1．8moJ／L層蔗糖片段則主要為III期黑素小 體。westernB10t 蛋白印跡結(jié)果顯示，sIatyMc晚期，黑素小體蛋白Dct 活性明顯減 低，與melm－aMc晚期黑素小體蛋白相比，差異具有 統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜O．05），而酪氨酸酶活性則在兩組黑素小體蛋 白之間變化不明 顯。
     3）實驗小鼠分組及免疫：將cB6F1（BAB［／c× C57B［／6雜交 Fl代，HLAl單倍型為H2d*2b）小鼠分籠飼養(yǎng)，分別給 予3種因素 處理黑素小體蛋白后免疫小鼠，比較其免疫原性的改 變：（1）將兩 種Mc分別用100μmoL／LH202處理1h，蔗糖梯度離心 分離早期和 晚期黑素小體蛋白，測定黑素在維持黑素小體蛋白低 免疫原性中所 發(fā)揮的作用；（2）將合成的DHI－優(yōu)黑素和DItICA－ 優(yōu)黑素分別與蔗 糖梯度離心分離的兩種Mc晚期黑素小體蛋白進(jìn)行孵育 ，經(jīng)H，0， 處理后來測定其抗氧化保護(hù)能力；（3）將蔗糖梯度 離心分離的兩種 Mc晚期黑素小體蛋白分別經(jīng)H202處理，驗證是否為 Dct突變slaty MC晚期黑素小體蛋白對氧化應(yīng)激更為敏感。另以O(shè)vA 作為陽性 對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑素小體蛋白（50μg）與等體積 的弗氏完全佐劑 （CFA）乳化皮下注射小鼠腳墊與鼠尾根部一周后， 肉眼可見小鼠免 疫側(cè)后肢沿腳墊向上逐漸腫脹。3周后，動物處死分 離區(qū)域引流淋 巴結(jié)時也發(fā)現(xiàn)，小鼠腹股溝、脅肋引流淋巴結(jié)及脾臟 明顯腫大。
     4）氧化應(yīng)激及合成的DHI／DHICA（1：1），優(yōu) 黑素對黑素小體蛋 白免疫原性的影響：將T淋巴細(xì)胞分離后盼藍(lán)染色計 數(shù)，接種相 同數(shù)目韻T淋巴細(xì)胞至96孔板（1×105／孔），加入 終濃度分別為 O．3、1、3、10、30μg／mL的同等黑素小體蛋白， 于37°c、5％C0， 共同孵育2天。每孔加入1uci。H－TdR繼續(xù)培養(yǎng)i4～ 16h，多頭樣 品細(xì)胞收集器收集細(xì)胞，用3H－TdR摻人法測定黑素 小體蛋白對T 細(xì)胞的回憶增殖反應(yīng)。用相同黑素小體蛋白包被酶標(biāo) 板，ELISA法 測定抗黑素小體蛋白抗體的終點稀釋滴度。顯微鏡下 觀察發(fā)現(xiàn)，自 H2C）z處理的slat）rMc分離獲得的晚期黑素小體蛋 白較早期黑素小 體蛋白T淋巴細(xì)胞克隆體積增大，胞漿增多而深染， 多呈圓形或 橢圓形；與DHI／DHICA（1：1）－優(yōu)黑素孵育的 slatyMC晚期黑素小 體蛋白較DHI－優(yōu)黑素孵育組T淋巴細(xì)胞克隆數(shù)目明顯 減少，單個 克隆體積變�。欢�與melan—aMC晚期黑素小體蛋白相 比，slatyMC 晚期黑素小體蛋白經(jīng)H2O2處理后較同等蛋白對照組T 淋巴細(xì)胞克 隆數(shù)目增多，單個克隆體積增大O33H—TdR摻入法和 ELISA法測定結(jié) 果也顯示，晚期黑素小體蛋白尤其是slatyMC晚期黑 素小體蛋白表 現(xiàn)為明顯的免疫原性增強(qiáng)；與DHI．優(yōu)黑素孵育的晚 期黑素小體蛋 白可明顯誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)和特異性抗晚期黑 素小體蛋白 血清lgG滴度增高；而且與melan—aMC相比，從 slatyMc分離的 晚期黑素小體蛋白對氧化應(yīng)激更為敏感，表現(xiàn)為T淋 巴細(xì)胞回憶 增殖反應(yīng)增強(qiáng)和特異性抗晚期黑素小體蛋白血清IgG 滴度增高。
     研究結(jié)論： Dct通過促進(jìn)一定比例的DHICA單體摻人到DHI聚 合骨架中， 影響著黑素的抗氧化能力，從而在維持黑素小體蛋白 低免疫原性中 發(fā)揮著重要的作用。而Dct突變則嚴(yán)重影響晚期黑素 小體的發(fā)育成 熟，同時致DHICA一優(yōu)黑素合成減少，ROS清除能力減 低，尤其是 細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下更為明顯。slaty突變（Dct基 因編碼區(qū)第194 位精氨酸被谷氨酰胺置換（R194Q））嚴(yán)重影響Dct蛋 白立體結(jié)構(gòu)和 黑素生成蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性，在持續(xù)或高氧化應(yīng)激 狀態(tài)下，黑素 小體蛋白可發(fā)生氧化修飾，使部分的隱蔽抗原表位暴 露，增強(qiáng)黑素 小體蛋白免疫原件。