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氧化應(yīng)激狀態(tài)下維持黑素小體蛋白低免疫原性的分子機制研究
《氧化應(yīng)激狀態(tài)下維持黑素小體蛋白低免疫原性 的分子機制研究》:研究背景及目的: 黑素為一組單體吲哚分子(DHI-優(yōu)黑素和DHI( :A.優(yōu)黑素),通 過共價鍵連接,并與醌和蛋白質(zhì)高度聚合而形成的一 種異質(zhì)性聚合 物(heterogeneouscopolymers)。這兩種吲哚分子 能以不同比例相互 交聯(lián)(cmss—linked),在共聚合過程中形成π-堆 疊(π-staeked)層狀 的大分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。在黑素生成過程中,多個黑素生 成蛋白參與對 黑素生成代謝的調(diào)控,共同影響著黑素生成的質(zhì)與量 。其中,Tyr 可催化L-酪氨酸羥化生成L-多巴和L一多巴氧化生 成L-多巴醌,為 黑素生成的限速酶。另一個重要的調(diào)節(jié)靶點是Dct催 化多巴色素異 構(gòu)重排生成5,6一二羥基吲哚羧酸(DHIC1A),然而 DHICA自身并 不能發(fā)生聚合,只有在DHI’和Tyr存在時,DHICA才 被摻人到黑 素聚合物中,否則多巴色素快速自發(fā)脫羧生成5,6一 二羥基吲哚 (DHI)和大量ROs。已有研究證實,三種黑素生成蛋 白(Tyr、 Tyrpl和Dct)在黑素小體內(nèi)組成一多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu), 目的是提高黑 素生化合成效率,維持酶蛋白自身的穩(wěn)定和最大限度 減少中間產(chǎn)物 的細(xì)胞毒性。
在多酶復(fù)合體中,Det被認(rèn)為是一種原位實時氧 化應(yīng)激清除劑 (reahimescavenger),它能瞬時清除中間產(chǎn)物所誘 生的活性氧基, 通過調(diào)節(jié)DHI/DHICA比例,動態(tài)影響著黑素生成和吲 哚分子的生 物聚合速率,從而調(diào)整黑素細(xì)胞對uVR的防護能力, 最終使皮膚 黑素生成增加。此外在黑素生化反應(yīng)過程中,黑素小 體內(nèi)部近似于 封閉的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是黑素細(xì)胞最大程度地減少黑素前 體物質(zhì)細(xì)胞毒 性的一種防護策略。黑素小體蛋白極有可能被包被于 黑素小體的各 個球形實體的內(nèi)核中,形成“盾樣”屏障結(jié)構(gòu),以保 護蛋白免遭氧 化攻擊。與此同時,黑素細(xì)胞還擁有強大的酶和非酶 抗氧化防護機 制(如谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、Fenton反 應(yīng)等),以瞬 時清除中間產(chǎn)物誘生的活性氧基,使黑素細(xì)胞和黑素 小體蛋白免遭 損傷。然而,對黑素小體蛋白與黑素聚合物之間的相 互作用及其在 高和或持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下,是如何免遭氧化應(yīng)激 損傷,以維持 其低免疫原性的機制仍知之甚少。 體內(nèi)外研究已證實過氧化氫(H202)在白癜風(fēng)患 者表皮內(nèi)大量 堆積,甚至高達毫摩爾濃度。且在白癜風(fēng)患者進展期 皮損和/或血 清中,已檢測到的多種抗黑素小體蛋白的自身抗體和 T淋巴細(xì)胞 表達異常。功能性的黑素細(xì)胞障礙或缺失被認(rèn)為是黑 素小體蛋白自 身反應(yīng)T細(xì)胞或自身抗體介導(dǎo)的一種免疫反應(yīng)。然而 ,白癜風(fēng)黑 素細(xì)胞Dct基因的功能調(diào)節(jié)失調(diào)和分子損傷機制是如 何發(fā)生的,免 疫系統(tǒng)是如何識別這些黑素小體內(nèi)膜上隱蔽的抗原表 位肽,黑素小 體蛋白免疫耐受的狀態(tài)又是如何遭到破壞的,至今仍 未清楚。新近 研究發(fā)現(xiàn),在一定濃度H2O2作用下,甲狀腺球蛋白可 發(fā)生斷裂, 生成具有免疫反應(yīng)性的多肽,這些多肽還能被橋本氏 甲狀腺炎病人 血清中抗甲狀腺球蛋白自身抗體所識別。因此我們推 測,激發(fā)對黑 素細(xì)胞的免疫破壞的始動因素可能為:(1)白癜風(fēng) 黑素細(xì)胞很可能 在清除黑素生成中間產(chǎn)物及活性氧基方面存在一定缺 陷,大量生成 的活性氧基分子(尤其是H202)可對已發(fā)生聚合的黑 素進行高強度 的攻擊,導(dǎo)致黑素聚合物中吲哚單位發(fā)生氧化斷裂, 使內(nèi)部隱蔽的 抗原表位肽暴露;(2)與吲哚單位相連的黑素小體 蛋白發(fā)生斷裂, 生成具有免疫反應(yīng)性的多肽如未能即使清除,則氧化 修飾后的蛋白 片段可能成為半抗原,具有強的免疫原性;(3)多 巴色素異構(gòu)酶 (Dct)滅活使DHJCA/DHI吲哚單位遭到破壞,喪失 其抗氧化能力, 甚至可能會表現(xiàn)為促氧化作用。 體內(nèi)直接研究Dot調(diào)控的氧化應(yīng)激改變對黑素小 體蛋白免疫原 性影響的早期上游事件十分困難,部分原因是由于 Dct在黑素小體 內(nèi)與其他黑素生成蛋白密切結(jié)合形成多酶復(fù)合物結(jié)構(gòu) 。因此在本研 究中,我們應(yīng)用蔗糖梯度離心法從Dct突變slatyrMC (第194位精氨 酸被谷氨酰胺置換,R194Q)和野生型melan-aMc分 離不同時期的 黑素小體蛋白,并將這些蛋白免疫小鼠的后腳墊,體 內(nèi)測定這兩種 黑素細(xì)胞衍生的黑素小體蛋白的免疫原性以及不同氧 化應(yīng)激狀態(tài)對 其免疫原性的影響,以期揭示白癜風(fēng)黑素細(xì)胞黑素小 體膜上的這些 自身蛋白抗原免疫耐受狀態(tài)破壞的分子機制和激發(fā)抗 黑素細(xì)胞自身 免疫反應(yīng)的始動事件。 劉小明專著的《氧化應(yīng)激狀態(tài)下維持黑素小體蛋 白低免疫原性的分子機制研究》:研究方法與結(jié)果: 1).Dct突變slatyMc和野生型n5elanIaMc內(nèi)黑 素生成相關(guān)蛋白 酶活性及ROS水平測定:分光光度計法測定Dct突變 slatyMC和 野生型melan-aMC內(nèi)Tyr(主要是多巴氧化酶)、Dct 和過氧化氫酶 活力。二氯熒光素(H2DCF-DA)標(biāo)記法測定兩種MC 在經(jīng)100 μmol/LH2O2處理前后胞內(nèi)ROs水平的變化。結(jié)果顯 示;與melan. aMc相比,slatyMcDct酶活力明顯減低,而Tyr、過氧 化氫酶活 性在兩組MC之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>O.05)。細(xì) 胞內(nèi)ROS水平 測定結(jié)果顯示,H202處理前,slatyMC和melan-aMC 胞內(nèi)的ROS 相對熒光強度分別為6.33±0.17和5.42±O.14, 但處理后,slaty Mc胞內(nèi)的ROS相對熒光強度(18.29±0.34)急劇增 加,與mehin.a(chǎn) MC(9.14±0.28)相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P <O.05)。 2)蔗糖梯度離心分離Dct突變slatyMC和野生型 melan—aMc 黑素小體超微結(jié)構(gòu)及其蛋白表達水平測定:將Dct突 變slatyMc和 野生型melan—aMc分別用0.25%胰酶/0.02%EDTA 消化,收獲細(xì) 胞后將細(xì)胞團塊勻漿,蔗糖梯度離心分離黑素小體。 蔗糖濃度梯度 分別為1.0、1.2、1.4、1.5、16、1.8和2. 0moL/L.取1.0~ 1.2moL/L和1.6—1.8mol/L梯度界面行透射電子 顯微鏡(TEM)觀 察黑素小體發(fā)育與成熟。分光光度計法和 WesternBlot蛋白印跡技 術(shù)測定蔗糖梯度離心片段三種酪氨酸酶家族蛋白酶活 性和蛋白表達 水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種MC勻漿團塊顏色分別為棕褐色 和奶黃色。 蔗糖梯度離心后,可見離心條帶分別位于1.0、1.2 、1.4、1.6、1.8 和2.0moL/L蔗糖界面上層。透射電子顯微鏡觀察發(fā) 現(xiàn),1.2~ 1.4mol/L層蔗糖片段主要富含呈球形或卵圓形的I .II期黑素小體 (早期黑素小體),1.6~l8mol,/L層蔗糖片段主 要富含以黑素沉積 在纖維狀橫嵴上為主的III—IV期黑素小體(晚期黑 素小體),與離心 分離的melan—aMc1.6~1.8mol/L層蔗糖片段相比 ,slatyMC 1.6~1.8moJ/L層蔗糖片段則主要為III期黑素小 體。westernB10t 蛋白印跡結(jié)果顯示,sIatyMc晚期,黑素小體蛋白Dct 活性明顯減 低,與melm-aMc晚期黑素小體蛋白相比,差異具有 統(tǒng)計學(xué)意義 (P<O.05),而酪氨酸酶活性則在兩組黑素小體蛋 白之間變化不明 顯。 3)實驗小鼠分組及免疫:將cB6F1(BAB[/c× C57B[/6雜交 Fl代,HLAl單倍型為H2d*2b)小鼠分籠飼養(yǎng),分別給 予3種因素 處理黑素小體蛋白后免疫小鼠,比較其免疫原性的改 變:(1)將兩 種Mc分別用100μmoL/LH202處理1h,蔗糖梯度離心 分離早期和 晚期黑素小體蛋白,測定黑素在維持黑素小體蛋白低 免疫原性中所 發(fā)揮的作用;(2)將合成的DHI-優(yōu)黑素和DItICA- 優(yōu)黑素分別與蔗 糖梯度離心分離的兩種Mc晚期黑素小體蛋白進行孵育 ,經(jīng)H,0, 處理后來測定其抗氧化保護能力;(3)將蔗糖梯度 離心分離的兩種 Mc晚期黑素小體蛋白分別經(jīng)H202處理,驗證是否為 Dct突變slaty MC晚期黑素小體蛋白對氧化應(yīng)激更為敏感。另以O(shè)vA 作為陽性 對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),黑素小體蛋白(50μg)與等體積 的弗氏完全佐劑 (CFA)乳化皮下注射小鼠腳墊與鼠尾根部一周后, 肉眼可見小鼠免 疫側(cè)后肢沿腳墊向上逐漸腫脹。3周后,動物處死分 離區(qū)域引流淋 巴結(jié)時也發(fā)現(xiàn),小鼠腹股溝、脅肋引流淋巴結(jié)及脾臟 明顯腫大。 4)氧化應(yīng)激及合成的DHI/DHICA(1:1),優(yōu) 黑素對黑素小體蛋 白免疫原性的影響:將T淋巴細(xì)胞分離后盼藍染色計 數(shù),接種相 同數(shù)目韻T淋巴細(xì)胞至96孔板(1×105/孔),加入 終濃度分別為 O.3、1、3、10、30μg/mL的同等黑素小體蛋白, 于37°c、5%C0, 共同孵育2天。每孔加入1uci。H-TdR繼續(xù)培養(yǎng)i4~ 16h,多頭樣 品細(xì)胞收集器收集細(xì)胞,用3H-TdR摻人法測定黑素 小體蛋白對T 細(xì)胞的回憶增殖反應(yīng)。用相同黑素小體蛋白包被酶標(biāo) 板,ELISA法 測定抗黑素小體蛋白抗體的終點稀釋滴度。顯微鏡下 觀察發(fā)現(xiàn),自 H2C)z處理的slat)rMc分離獲得的晚期黑素小體蛋 白較早期黑素小 體蛋白T淋巴細(xì)胞克隆體積增大,胞漿增多而深染, 多呈圓形或 橢圓形;與DHI/DHICA(1:1)-優(yōu)黑素孵育的 slatyMC晚期黑素小 體蛋白較DHI-優(yōu)黑素孵育組T淋巴細(xì)胞克隆數(shù)目明顯 減少,單個 克隆體積變;而與melan—aMC晚期黑素小體蛋白相 比,slatyMC 晚期黑素小體蛋白經(jīng)H2O2處理后較同等蛋白對照組T 淋巴細(xì)胞克 隆數(shù)目增多,單個克隆體積增大O33H—TdR摻入法和 ELISA法測定結(jié) 果也顯示,晚期黑素小體蛋白尤其是slatyMC晚期黑 素小體蛋白表 現(xiàn)為明顯的免疫原性增強;與DHI.優(yōu)黑素孵育的晚 期黑素小體蛋 白可明顯誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖反應(yīng)增強和特異性抗晚期黑 素小體蛋白 血清lgG滴度增高;而且與melan—aMC相比,從 slatyMc分離的 晚期黑素小體蛋白對氧化應(yīng)激更為敏感,表現(xiàn)為T淋 巴細(xì)胞回憶 增殖反應(yīng)增強和特異性抗晚期黑素小體蛋白血清IgG 滴度增高。 研究結(jié)論: Dct通過促進一定比例的DHICA單體摻人到DHI聚 合骨架中, 影響著黑素的抗氧化能力,從而在維持黑素小體蛋白 低免疫原性中 發(fā)揮著重要的作用。而Dct突變則嚴(yán)重影響晚期黑素 小體的發(fā)育成 熟,同時致DHICA一優(yōu)黑素合成減少,ROS清除能力減 低,尤其是 細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下更為明顯。slaty突變(Dct基 因編碼區(qū)第194 位精氨酸被谷氨酰胺置換(R194Q))嚴(yán)重影響Dct蛋 白立體結(jié)構(gòu)和 黑素生成蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性,在持續(xù)或高氧化應(yīng)激 狀態(tài)下,黑素 小體蛋白可發(fā)生氧化修飾,使部分的隱蔽抗原表位暴 露,增強黑素 小體蛋白免疫原件。
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