實習一 組織學緒論
學習要點
掌握：顯微鏡的結構及其使用方法。
了解：石蠟切片、HE染色標本制作過程。
組織學是研究正常人體的微細結構及其相關功能的科學,主要研究工具是顯微鏡。組織學實訓課是通過正確而熟練地在鏡下識別主要器官的結構及其基本組織和細胞成分,描述標本組織切片的特點,驗證課堂講授的理論知識,使理論與實際相結合的課程。通過實訓課的直接觀察,加強形態(tài)學描述和描繪技能訓練,培養(yǎng)分析問題和解決問題的能力,加深對理論知識的理解,牢固地掌握組織學基本知識。
一、顯微鏡的結構及使用
顯微鏡是醫(yī)學科學中常用的貴重精密光學儀器之一,是組織學實習的主要工具。在使用過程中應對同學作如下的要求： ① 熟悉顯微鏡各部分的性能和用途,仔細小心,養(yǎng)成正規(guī)操作的習慣；② 掌握顯微鏡觀察和分析組織標本的技能；③ 自覺遵守顯微鏡管理和使用制度,嚴防損壞。
（一） 顯微鏡的主要結構
1. 機械裝置部分鏡體、目鏡筒、載物臺、標本夾、標本移動器、物鏡轉(zhuǎn)換器、粗調(diào)節(jié)螺旋、細調(diào)節(jié)螺旋、屈光度調(diào)節(jié)環(huán)、孔徑光闌調(diào)節(jié)桿、電源開關、亮度調(diào)節(jié)鈕、聚光器升降桿。
圖11顯微鏡的結構
2. 光學系統(tǒng)部分目鏡（放大倍數(shù)為8×或10×）、物鏡（包括放大鏡×4、低倍鏡×10、高倍鏡×40、油鏡×100）、聚光器、光源。
請根據(jù)圖示熟悉顯微鏡的結構,并熟練掌握使用方法。
（二） 顯微鏡的使用方法
1. 取放自鏡箱中取出或放入顯微鏡時,應以右手握住鏡臂,左手托鏡座,使鏡身保持平穩(wěn)。拿顯微鏡時,要輕拿輕放,嚴禁鏡身傾斜,前后搖擺,致使目鏡或反光鏡脫落損毀,以免碰壞顯微鏡。
2. 使用前后均要進行檢查經(jīng)常保持顯微鏡的清潔,顯微鏡上的各種配件不可任意取下或拆開,如有損壞要及時報告并登記,以便處理與修復。如有油脂沾污,可沾少許二甲苯輕擦。切勿用手或手帕和其他紙張擦光學部分,以免磨損。
3. 電源打開電源開關,適當調(diào)整電壓（或光線亮度）。
4. 對光轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器,對正低倍物鏡,肉眼從鏡側注視,轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)螺旋使接物鏡距載物臺平面5mm左右。眼睛從目鏡觀察,適當調(diào)整光亮,整個視野均勻為準。從雙筒顯微鏡的目鏡中觀看時,應根據(jù)個人的眼距不同,調(diào)節(jié)兩目鏡之間的距離,使兩個視野重合為一個大的視野。
5. 標本放置和視野調(diào)整將標本用卡片器固定好,調(diào)整切片位置使標本對準聚光中心,以便觀察。以左手調(diào)節(jié)粗細螺旋,右手移動推進器。如視野偏暗、明暗不勻或模糊時,可從以下幾方面檢查并作適當處理： ① 物鏡是否對正？② 聚光器光圈開得大小如何？③ 聚光器的高低如何？④ 目鏡、物鏡、聚光器的集光鏡是否沾污？
6. 觀察完畢將標本取下,按編號順序放入標本盒內(nèi)。關閉電源開關,注意程序是： ① 將光源關至最小；② 關掉電源開關；③ 拔掉插頭。
（三）正確地進行標本觀察
觀察標本時要明確本次實習的目的與要求,按照實習指導進行。首先了解標本的名稱、取材部位、制片方法、切片方位及染色方法,然后按照肉眼觀察、低倍鏡觀察和高倍鏡觀察的順序進行系統(tǒng)觀察標本。
特別需要指出的是： 應重視低倍鏡下的觀察,了解組織切片的全貌、層次、部位關系,有許多標本,在低倍鏡下即可達到觀察的主要目的。而高倍鏡下觀察的只是局部結構的放大。切勿放置標本后立即用高倍鏡觀察或?qū)ふ夷繕?這樣會迷失方位,限制視野,混淆層次,建立不起整體概念,以致觀察結果不全面、不準確,甚至錯誤。這是一般初學者易犯的毛病,希望引起高度重視。
1. 肉眼觀察對著白色背景用肉眼觀察標本的大小、形狀、顏色及取材方位。
2. 低倍鏡觀察取標本,擦凈,使蓋玻片朝上而載玻片在下,放在載物臺上,用卡片器夾好,并用推進器將標本移到載物臺通光孔正中。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器,將低倍物鏡（×4或×10）對準標本,慢慢旋轉(zhuǎn)粗螺旋,鏡頭下降至近玻片,從目鏡觀察,同時慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)螺旋,使物鏡緩緩上升,調(diào)節(jié)焦點距離,直至看到清晰的物像為止。觀察標本時,如果光線太強,或標本染色太淺,透明度較大,可將光調(diào)暗；反之,如果光線太暗或標本染色很深,應將光學調(diào)亮。總之,要使光亮適宜觀察。
3. 高倍鏡觀察目的是對某些部位的結構進一步放大觀察,以了解其微細構造,是在完成低倍鏡觀察要求的前提下進行的。先將選好需要觀察的部位移至視野正中,然后轉(zhuǎn)換高倍鏡（×40）,進行觀察,應用細螺旋調(diào)節(jié)焦距,看到清晰物像。注意不要用粗螺旋調(diào)節(jié)焦距壓碎玻片,甚至將鏡頭損壞。達到高倍鏡觀察目的后,還可再用低倍鏡觀察,這樣低倍、高倍鏡反復使用,使一般與特殊緊密結合。
4. 油鏡觀察實習課中僅在觀察血液和骨髓涂片時需要使用。也應遵循肉眼、低倍、高倍的順序進行初步觀察。將選好的觀察部位移至視野中央,先提高鏡筒,轉(zhuǎn)換油鏡頭（×100）,再在標本上滴一滴鏡油,小心地將鏡筒下降,同時肉眼看著將鏡頭浸入油內(nèi),并可使之與標本輕微接觸。然后一方面用眼睛自目鏡觀察,一方面慢慢轉(zhuǎn)動細螺旋使鏡筒微微上升,直到看清物象后,再用細螺旋繼續(xù)調(diào)節(jié),進行觀察。注意,切不可用下降鏡筒的辦法對焦點,這樣是容易損壞標本的。
注意： 應用鏡油的時候,切不可將鏡油接觸到高倍鏡和低倍鏡的鏡頭,否則的話,將造成應用高倍鏡和低倍鏡觀察模糊,影響學習。實習完畢后,先用擦鏡紙擦凈物鏡上的油,再換一張紙,滴少許二甲苯輕輕擦凈鏡面上的油跡,再換一張擦鏡紙擦去二甲苯。標本上的油跡也用此法清除。
（四） 觀察標本時應注意的事項
1. 注意標本的平面與立體的關系人體結構極為復雜,就同一個器官或細胞來說,它是一個立體結構,圖12雞蛋的各種切面
但切片標本所觀察的圖像是平面的,所切的部位不同或者所切的方向不同,則切片所顯示的物像就不相同。因此在觀察時,要建立起立體概念。例如,我們將一個細胞用一個雞蛋表示,通過不同方向和部位所作的各種切面,則可得到不同的物像,如圖12所示。若對呈輻射狀排列的細胞群體作各種切面,其各種物像如圖13所示。若對呈管狀的器官作各種切面,其形狀如圖14、15所示；若對呈束狀的器官作各種切面,其形狀如圖16所示。
2. 注意標本的不同生理動態(tài)變化機體在不同生理情況下,同一組織結構是有改變的,如腺體在分泌過程中,其細胞構造就不斷地發(fā)生著變化。所以,在觀察時要有一個動態(tài)的觀點。
圖13輻射狀排列的細胞群的各種切面
圖14弓形管狀結構的各種切面
圖15管狀器官的各種切面
圖16束形器官的各種切面
3. 注意標本的多種染色方式的綜合運用我們所觀察的標本是死組織,是經(jīng)過復雜的技術過程制成的,而且一張標本只能用某一種染色方法制作。因此,它不能夠顯示出組織、細胞所有的結構。所以,在實習過程中還要觀察一些示教材料如特殊染色等,以補不足。同時要將這些不同的材料、標本進行綜合分析,使認識更加全面與深刻。
4. 注意標本中的人為現(xiàn)象由于制片技術上的原因,有時在標本中會出現(xiàn)一些人為缺陷,并非組織結構,應予鑒別。包括以下幾種： ① 刀痕： 因切片刀鋒有缺口造成組織標本縱行刀痕。② 裂紋： 組織透明、浸蠟的時間過長,組織脆硬,切片時可引起組織裂開,呈不規(guī)則裂紋。在制片過程中,由于組織或細胞各部分結構的收縮不一致,或貼片時水溫過高,也可導致某些人為裂隙。③ 皺褶： 貼片時組織未充分展平或標本鋪得不平整而發(fā)生皺褶。④ 氣泡： 封片時將少許空氣封入切片樹膠中。⑤ 遺留物： 如染色時殘留的染料沉渣或固定液化學物質(zhì)沒有除凈而出現(xiàn)的沉淀物等。
（五） 觀察記錄與繪圖
組織學實習的觀察記錄主要是繪圖描記所見,它可以幫助理解與記憶。繪圖時要突出主要內(nèi)容,力求準確地表現(xiàn)出組織結構的特點及其相互關系。繪圖可用有色鉛筆,注字用普通鉛筆。繪圖要求比例適當,描繪準確,注字工整,以養(yǎng)成嚴謹?shù)目茖W態(tài)度。
二、 組織學標本制作的基本過程與原理
1. 目的： 了解組織學標本制作的程序和各步驟的作用。
2. 標本制作要求： ① 盡可能保存組織生前結構；② 標本要透明,可容顯微鏡下的光線通過；③ 不同的結構在顯微鏡下必須能顯出不同影像；④ 標本可長期保存以供長期觀察。
組織學的研究方法很多,但概括起來可分為兩類：
（1） 活體觀察： 即觀察細胞、組織或器官在生活時的形態(tài)結構,不易長期保存,而且有許多結構不能看到。在組織學實訓課中一般不用這種方法的。
（2） 死后觀察： 即從致死或近死的機體中取出組織或器官,經(jīng)過標本固定等技術處理、制成標本,觀察其形態(tài)結構,并根據(jù)形態(tài)變化推測生活時的狀態(tài)。該方法的優(yōu)點是可以顯示出各種不同變化經(jīng)過的成分,所制標本又能長期保存,反復觀察。在實訓中所觀察的都是這類標本。
普通常用的組織標本制作過程及其基本原理簡介如下：
石蠟包埋切片標本制作法
石蠟包埋切片、蘇木精伊紅染色法是最常用的組織學標本制作方法,包括以下幾個步驟： 取材、固定、水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、染色、脫水、透明和封固。
1. 取材、固定
（1） 取材： 即從動物體內(nèi)取下某一器官或組織材料的過程,大小約0.5cm3為宜,盡量保證為新鮮組織材料。材料的來源一般是來自尸檢或取自實驗動物。因此,動物在麻醉下或以不同方法致死后,應立即進行取材,操作宜細致迅速,要盡量減少細胞、組織在機體死后的改變和避免對組織的機械損傷。組織在動物死后或離體后會很快解體,原因可能是由于細菌或是組織本身所含酶的分解所致。取材后要立即進行固定,以停止其分解作用,盡可能保存細胞組織生前結構和成分。
（2） 固定： 固定作用是一種化學及物理過程,使其蛋白質(zhì)等成分迅速凝固,其目的是為防止組織的自溶和細菌的侵入,使組織固定硬化,以保持其在取材時的形態(tài)結構。固定時所使用的化學溶液,稱為固定液。
常用的固定劑有： ① 單純固定劑： 即用單一的化學物質(zhì)配制成的固定液。如乙醇、甲醛、乙酸、鋨酸等。② 混合固定劑： 用數(shù)種化學物質(zhì)配制成的固定液。一般來講,采用混合固定液較好,但固定液的選擇,以組織的種類不同和顯示組織組成成分的目的需求不同而異。常用的固定液配方：
Ⅰ. Susa液： Ⅰ液氯化汞（升汞）飽和水溶液 50.0mlⅡ液氯化鈉 0.5g三氯乙酸 2.0g冰醋酸 4.0ml甲醛（40％） 20.0ml蒸餾水 30.0ml 使用時取等量的Ⅰ液和Ⅱ液混合后,將組織塊投入,固定24h。
Ⅱ. Helly干液： 重鉻酸鉀 2.5g氯化汞 5.0g硫酸鈉 1.0g蒸餾水 100.0ml 使用之前加入40％甲醛5.0ml。
Ⅲ. 10％甲醛： 甲醛 10.0ml蒸餾水 90.0ml Ⅳ. Bouin液： 苦味酸飽和水溶液 75.0ml40%甲醛 25.0ml冰醋酸 5.0ml