《細胞生物學(xué)實驗（第二版）/生命科學(xué)核心課程系列教材》：
　　第一部分 基礎(chǔ)性實驗
　　實驗1普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及使用
　　【實驗?zāi)康摹?br /> 　　1. 熟悉普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造和性能。
　　2. 掌握普通光學(xué)顯微鏡的正確使用方法。
　　【實驗原理】
　　一、普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造
　　普通光學(xué)顯微鏡是最常用的一種光學(xué)顯微鏡，主要由機械系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)組成（圖1-1）。
　　圖1-1 普通光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖
　　1. 目頭；2. 目鏡；3. 鏡頭固緊螺釘；4. 物鏡轉(zhuǎn)換器；5. 物鏡；6. 載物臺；7. 聚光鏡升降旋鈕；8. 聚光鏡固緊螺釘；9. 聚光鏡（帶光圈）；10. 下聚光鏡；11. 亮度旋鈕；12. 電源開關(guān)；13. 推動器橫向移動旋鈕；14. 推動器縱向移動旋鈕；15. 細調(diào)旋鈕；16. 粗調(diào)旋鈕；17. 標本夾；18. 鏡臂；19. 鏡座
　�。ㄒ唬�機械系統(tǒng)
　　機械系統(tǒng)是顯微鏡的重要組成部分，其作用是固定與調(diào)節(jié)光學(xué)鏡頭、固定與移動標本等，主要由鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、推動器與調(diào)焦裝置組成。
　　1. 鏡座
　　鏡座是顯微鏡的基本支架，它由底座和鏡臂兩部分組成。在它上面連接有載物臺和鏡筒，它是用來安裝光學(xué)系統(tǒng)部件的基礎(chǔ)。
　　2. 鏡筒
　　鏡筒是位于鏡臂前方的圓筒，上端安裝目鏡，下端連接物鏡轉(zhuǎn)換器。根據(jù)鏡筒的數(shù)目，光鏡可分為單筒式和雙筒式，單筒式又分為直立式和傾斜式兩種，而雙筒式的鏡筒均為傾斜式，現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡大多為雙筒式。
　　從物鏡的后緣到鏡筒尾端的距離稱為機械筒長。物鏡的放大率是相對一定的鏡筒長度而言的。鏡筒長度發(fā)生變化，不僅放大率隨之變化，而且成像質(zhì)量也受到影響。因此，使用顯微鏡時，不能任意改變鏡筒長度。國際上將顯微鏡的標準筒長定為160mm，此數(shù)字標在物鏡的外殼上。
　　3. 物鏡轉(zhuǎn)換器
　　物鏡轉(zhuǎn)換器位于鏡筒下端，是一個可以轉(zhuǎn)動的圓盤，一般有3～4 個物鏡接口用以安裝放大倍數(shù)不同的物鏡。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，可以按需要將其中的任何一個物鏡和鏡筒接通，與鏡筒上面的目鏡構(gòu)成一個放大系統(tǒng)。
　　4. 載物臺
　　載物臺也稱鏡臺，位于鏡筒的下方，方形或圓形，用于放玻片標本。載物臺中央有一孔，為光線通路。在載物臺上裝有彈簧標本夾和推動器，其作用為固定或移動標本，使得鏡檢對象恰好位于視野中心。
　　5. 推動器
　　推動器是移動標本的機械裝置，由一橫一縱兩個推進齒軸的金屬架構(gòu)成，好的顯微鏡在縱、橫架桿上刻有刻度標尺，構(gòu)成很精密的平面坐標系。如果需要重復(fù)觀察標本的某一部分，在第一次檢查時，可記下縱、橫標尺的數(shù)值，以后按數(shù)值移動推動器，就可以找到原來標本的位置。
　　6. 調(diào)焦裝置
　　調(diào)焦裝置一般位于鏡臂的下端，是移動鏡筒調(diào)節(jié)物鏡和標本間距離的機件，包括粗調(diào)旋鈕和細調(diào)旋鈕。粗調(diào)旋鈕旋轉(zhuǎn)一圈可使載物臺升降 10mm，一般用于低倍鏡調(diào)焦。細調(diào)旋鈕每轉(zhuǎn)一圈可使載物臺緩慢升降0.1mm（100μm），一般用于高倍鏡、油鏡和分辨物像清晰度調(diào)焦。
　�。ǘ�）光學(xué)系統(tǒng)
　　普通光學(xué)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反光鏡、聚光器、物鏡、目鏡等組成。聚光器、物鏡、目鏡各自相當于一個正透鏡，顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)就是根據(jù)透鏡成像的原理對微小物體進行放大的。其基本成像原理：被檢物放在聚光器和物鏡之間，光線通過物鏡在鏡筒中形成一個倒立的放大實像，目鏡又將此倒立實像進一步放大成倒立虛像，通過調(diào)焦裝置使此虛像落在人眼實驗1 普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及使用的明視距離（250mm）處，即倒立虛像通過眼球后，在視網(wǎng)膜上形成正立實像，此實像與倒立虛像相吻合（圖1-2）。
　　1. 反光鏡
　　反光鏡位于鏡座上，是一個可以隨意轉(zhuǎn)動的雙面鏡。一面為平面，一面為凹面，其作用是將從任何方向射來的光線反射到聚光器透鏡的中央，照明標本。平面鏡反射光線的能力較弱，在光線較強時使用；凹面鏡反射光線的能力較強，在光線較弱時使用。較新的高檔光學(xué)顯微鏡鏡座上裝有光源，并有電流調(diào)節(jié)旋鈕，可通過調(diào)節(jié)電流大小調(diào)節(jié)光照強度。
　　2. 聚光器
　　聚光器在載物臺下面，由聚光鏡、光圈和升降旋鈕組成。其作用是將光源經(jīng)反光鏡反射來的光線聚焦于樣品上，以得到最強的照明，使物像獲得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以用升降旋鈕調(diào)節(jié)，使焦點落在被檢物體上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦點在其上方1.25mm 處，而其上升限度為載物臺平面下方0.1mm。因此，要求使用的載玻片厚度為0.8～1.2mm，否則被檢樣品不在焦點上，影響鏡檢效果。聚光器前透鏡組前面還裝有可變光闌，也稱光圈，位于聚光鏡的下方，由十幾張金屬薄片組成，中心部分形成圓孔。其作用是調(diào)節(jié)光強度和使聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑相適應(yīng)�？勺児怅@開得越大，數(shù)值孔徑越大。
　　3. 物鏡
　　物鏡安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，物鏡的性能取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numerical apeature，N.A.），每個物鏡的數(shù)值孔徑都標在物鏡的外殼上，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。
　　一般根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質(zhì)不同，可分為：①干燥系物鏡，以空氣為介質(zhì)，如常用的40×以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。②油浸系物鏡，常以香柏油為介質(zhì)，此物鏡又稱油鏡頭，其放大率為90×～100×，數(shù)值孔徑大于1。各種物鏡的技術(shù)參數(shù)見表1-1。
　　4. 目鏡
　　目鏡裝在鏡筒上端，通常由兩塊透鏡組成，上端的透鏡稱為接目鏡，下端的透鏡稱為場鏡。上下透鏡之間或在兩個透鏡的下方，裝有金屬制的環(huán)狀光闌或稱視場光闌，物鏡放大后的中間像就落在視場光闌平面處，所以其上可安置目鏡測微尺。一般在目鏡的側(cè)面刻有放大倍數(shù)，如5×、10×、15×等，最常用的是10×目鏡。
　　圖1-2 顯微鏡成像原理圖
　　二、普通光學(xué)顯微鏡的性能
　　顯微鏡的性能指標主要有分辨率、放大率、焦點深度、鏡像亮度和視場亮度等，這些指標都有一定的限度，彼此間相互作用又相互制約。
　　1. 分辨率
　　分辨率又稱分辨力，物鏡的分辨率即顯微鏡的分辨率。目鏡與顯微鏡的分辨率無關(guān)，物鏡分辨率是指能清晰地分辨被檢樣品中兩個物體點的最短距離的能力。這兩點之間的距離即為其分辨率，這個距離越近，其分辨率越高。人眼的分辨率可達0.1mm，而普通光學(xué)顯微鏡的分辨率可達0.2μm。分辨率的計算公式為
　　R=0.61λ/N.A.
　　N.A.=nsin（α /2）
　　式中，R 為分辨率；λ 為照明光線波長；N.A.為物鏡數(shù)值孔徑；n 為介質(zhì)的折射率；α 為透鏡的孔徑角。照明光線波長越短，物鏡的數(shù)值孔徑越大，顯微鏡的分辨率越大。
　　2. 放大率
　　放大率也稱為放大倍數(shù)。顯微鏡的總放大率等于目鏡和物鏡放大率的乘積。物鏡放大率是相對一定鏡筒長度而言的，鏡筒長度的變化，不僅導(dǎo)致放大率發(fā)生變化，而且成像質(zhì)量也受到影響。適宜的總放大率是所用物鏡數(shù)值孔徑的500～1000 倍，在此范圍內(nèi)稱為有效放大率。如果高于上述范圍，微細結(jié)構(gòu)分辨不清，為空的放大。低于上述范圍時由于放大率過低，難以觀察。
　　3. 焦點深度
　　當顯微鏡對被檢樣品的某一點或平面準焦時，影像的清晰范圍，不局限于這一點或面，在其上下的一定距離或深度內(nèi)也是清晰的。這段清晰的距離或深度，就稱為焦點深度，簡稱焦深。顯微鏡的焦深可變，它與物鏡的數(shù)值孔徑和總放大率成反比。因此高放大率和高數(shù)值孔徑的顯微鏡焦深就淺，需邊觀察邊調(diào)節(jié)焦距，才能看到標本的全厚度。
　　4. 鏡像亮度和視場亮度
　　鏡像亮度是指顯微鏡下圖像的明暗程度，其數(shù)值與物鏡的數(shù)值孔徑的平方成正比，與總放大率成反比。視場亮度是指顯微鏡下整個視場的明暗程度。視場亮度不僅與目鏡、物鏡有關(guān)，還受聚光器、可變光闌和光源等因素的影響。在不更換物鏡和目鏡的情況下，視場亮度越大，鏡像亮度也越大。
　　【實驗材料】
　　人口腔黏膜上皮細胞裝片。
　　【實驗試劑】
　　香柏油、二甲苯。
　　【實驗器材】
　　普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙。
　　【實驗步驟】
　　取人口腔黏膜上皮細胞裝片練習普通光學(xué)顯微鏡的使用操作及注意事項。
　　一、觀察前的準備
　　（1）取顯微鏡時，應(yīng)用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡放到實驗臺上。
　�。�2）顯微鏡一般放在身體的左前方，離桌子邊緣約10cm，右側(cè)可放記錄本或繪圖紙。
　�。�3）調(diào)節(jié)光照：將10×物鏡轉(zhuǎn)入光孔，聚光器上的光圈開到最大位置，左眼觀察目鏡中視野的亮度，轉(zhuǎn)動反光鏡，使視野的光照達到明亮均勻為止。自帶光源的顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電流旋鈕來調(diào)節(jié)光照強弱。
　�。�4）調(diào)節(jié)光軸中心：在觀察時，顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸在同一條直線上。帶視場光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用10×物鏡觀察，在視場內(nèi)可見到視場光闌圓球多邊形的輪廓像，如此像不在視場中央，可利用聚光器外側(cè)的兩個調(diào)整旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，若能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓像完全與視場邊緣內(nèi)接，則說明光線已經(jīng)合軸。
　　二、低倍鏡觀察
　　鏡檢標本時需先用低倍鏡觀察。因為低倍鏡視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標和確定檢查的位置。標本裝片置于載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器，使被觀察的標本位于物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標本處，用目鏡觀察，同時旋轉(zhuǎn)粗調(diào)旋鈕慢慢升起鏡筒（或下降載物臺），直至物像出現(xiàn)，再用細調(diào)旋鈕調(diào)焦使物像清晰。用推動器移動標本裝片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進行觀察。
　　三、高倍鏡觀察
　　在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍鏡頭、高倍鏡頭是同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應(yīng)碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號的物鏡，在轉(zhuǎn)換物鏡時要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)旋鈕，使載物臺上升（或鏡筒下降），直至物像出現(xiàn)，再用細調(diào)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進行觀察。
　　四、油鏡觀察
　　油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，使用油浸物鏡時要特別細心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標本裝片并使物鏡受損。使用油鏡按下列步驟操作。
　　（1）先用粗調(diào)旋鈕將鏡筒提升（或?qū)⑤d物臺下降）約2cm，并將高倍物鏡轉(zhuǎn)出。
　　（2）在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。
　�。�3）從側(cè)面注視，用粗調(diào)旋鈕將載物臺緩緩地上升（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標本接觸。
　�。�4）向目鏡內(nèi)觀察，放大視場光闌及聚光鏡上的光圈，上調(diào)聚光器，使光線充分照明。
　　用粗調(diào)旋鈕將載物臺徐徐下降（或鏡筒上升），當出現(xiàn)物像后改用細調(diào)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物像，必須再從側(cè)面觀察，重復(fù)上述操作。
　�。�5）觀察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚乙醇混合液（乙醚2 份，無水乙醇3 份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留的油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2～3 下即可（注意向一個方向擦拭）。
　　（6）將各部分還原，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡鏡頭不與載物臺通光孔相對，再將鏡筒下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個干凈手帕將目鏡罩好，以免目鏡鏡頭沾上灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。
　　【實驗結(jié)果】
　　低倍鏡、高倍鏡、油鏡觀察人口腔黏膜上皮細胞時，觀察范圍依次變小，放大倍數(shù)、分辨率依次提高。
　　【注意事項】
　　1. 取放顯微鏡時要輕拿輕放，持鏡時要一手握鏡臂，另一只手托住鏡座，不可單手提取，以免零件脫落或碰撞到其他地方。不可將顯微鏡放置在實驗臺邊緣，鏡筒傾斜角度不要超過45°，以防碰翻落地。
　　2. 上升載物臺、轉(zhuǎn)換物鏡時，一定要從顯微鏡的側(cè)面注視著，以免物鏡與標本接觸，造成鏡頭或標本裝片的損壞。
　　3. 轉(zhuǎn)換物鏡時應(yīng)轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，切勿手持物鏡移動。
　　4. 玻片標本待觀察部位要正對載物臺的通光孔，且不能放反，否則高倍鏡和油鏡下找不到物像。
　　5. 粗調(diào)旋鈕、細調(diào)旋鈕要配合使用，使用細調(diào)旋鈕時，用力要輕，轉(zhuǎn)動要慢，細調(diào)旋鈕不能單方向過度旋轉(zhuǎn)。
　　6. 切勿任意拆卸顯微鏡的零件，不要隨便取出物鏡、目鏡。
　　7. 顯微鏡使用完畢后，要將玻片取出，下降載物臺，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器使鏡頭離開通光口，豎立反光鏡，蓋上外罩，放回顯微鏡柜內(nèi)。
　　8. 保持顯微鏡清潔，避免灰塵、水及化學(xué)試劑污染顯微鏡。光學(xué)和照明部分只能用擦鏡紙擦拭，機械部分可以用布擦拭。
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