本書涵蓋了動物細胞制藥基因工程近年來的最新的關鍵技術及相關進展，圍繞動物細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白質藥物的關鍵技術，從動物細胞培養(yǎng)、動物細胞載體、目的基因導入、重組穩(wěn)定細胞株篩選和評估、重組蛋白分離純化、重組蛋白藥物鑒定與分析、重組蛋白藥物新技術等方面，介紹了動物細胞制藥領域的關鍵技術及新技術。
1.本書反映了近十年來基因工程的新進展
2.本書匯聚了基因工程的成果與技術
3.內(nèi)容全面、實用性強，基因工程研究領域必看
1972年首次成功在體外完成DNA分子的重組改造，標志著基因工程技術的誕生。目前，基因工程技術已廣泛應用在藥物研發(fā)和生產(chǎn)領域，尤其是利用動物細胞生產(chǎn)重組蛋白藥物已成為現(xiàn)代生物制藥中最常用的技術手段之一。
相比細菌、酵母等表達系統(tǒng)，動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導蛋白質正確折疊，提供復雜的糖基化修飾等翻譯后加工等。目前批準上市的近 80%的重組蛋白藥物來源于動物細胞表達系統(tǒng)。近30年來特別是近10年來，科研工作者圍繞動物細胞表達系統(tǒng)做了大量卓有成效的工作，重組蛋白藥物的產(chǎn)量和質量都有很大提高。國內(nèi)的企業(yè)和科研機構主要參考國外相關實驗指導及自己建立的重組蛋白藥物研發(fā)流程進行實驗設計和實施，尚無一本動物細胞基因工程生產(chǎn)重組蛋白藥物技術方面的專著。
鑒于以上原因，在長期的科研活動中，我們不斷總結經(jīng)驗，交流學習，在查閱國內(nèi)外大量相關文獻的基礎上，結合自己的實踐，編著了這本《基因工程——動物細胞制藥關鍵技術》。全書共分七個章節(jié)，包括動物細胞培養(yǎng)、動物細胞載體、目的基因導入、重組穩(wěn)定細胞株篩選和評估、重組蛋白分離純化、重組蛋白藥物鑒定與分析、重組蛋白藥物新技術等內(nèi)容。
本書可作為從事生物制藥方向的研究人員及研究生的指導用書，也可以作為藥學等相關專業(yè)本科生的實驗指導教材。參加本書撰寫的人員主要來自河南省重組藥物蛋白表達系統(tǒng)國際聯(lián)合實驗室、新鄉(xiāng)醫(yī)學院、抗體藥物與靶向治療國家重點實驗室、國家藥品監(jiān)督管理局治療類單抗質量控制重點實驗室及華蘭基因工程有限公司的科研及生產(chǎn)工作一線人員。他們具有多年豐富的重組蛋白藥物研發(fā)、藥物質量控制等方面經(jīng)驗，為本書的編寫投入了大量的精力。另外，化學工業(yè)出版社編輯在本書的編輯加工中做了大量細致的工作，在此對他們表示衷心的感謝！
因著者水平有限，加之日常繁重的教學、科研等各種工作，盡管每位著者都付出了辛勤的勞動，仍不免出現(xiàn)疏漏和不足，敬請各位讀者提出寶貴意見，以便再版時改正！
著者
2023年1月
王天云，博士，教授，博士生導師。新鄉(xiāng)醫(yī)學院“太行學者”特聘教授。河南省重組藥物蛋白表達系統(tǒng)國際聯(lián)合實驗室及生物創(chuàng)新藥物工程技術研究中心主任，中國生物化學與分子生物學會理事，河南省生物化學與分子生物學會理事長，教育部“長江學者”，國家科技進步獎評審專家。主持國家自然科學基金4項，省重大科技專項1項，創(chuàng)新杰出人才項目1項；參與國家“863”課題、國家重大科技專項各1項。獲省科技進步二等獎2項、三等獎1項。申請國家發(fā)明專利35項，已授權16項。發(fā)表研究論文86篇，其中SCI收錄53篇，被引1076次。長期從事哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的研究，建立了國際水平的哺乳細胞表達系統(tǒng)，包括高效表達載體、細胞系及培養(yǎng)基。已實現(xiàn)技術轉移2項，專利轉化8項。
第一章 動物細胞培養(yǎng) 001
第一節(jié) 動物細胞培養(yǎng)基礎知識 002
一、基本概念 002
二、動物細胞培養(yǎng)條件 003
三、動物細胞培養(yǎng)實驗室 004
四、無菌技術 006
第二節(jié) 動物細胞培養(yǎng)技術 007
一、動物細胞凍存與復蘇 007
二、動物細胞傳代 009
三、動物細胞懸浮馴化及無血清培養(yǎng) 011
四、動物細胞分批培養(yǎng) 015
五、動物細胞補料分批培養(yǎng) 016
六、動物細胞灌流技術培養(yǎng) 022
第三節(jié) 動物細胞生物特性分析 025
一、動物細胞生長曲線和倍增時間分析 025
二、動物細胞增殖測定 028
三、動物細胞凋亡檢測 031
四、動物細胞周期檢測 036
參考文獻 038
第二章 動物細胞載體 041
第一節(jié) 質粒載體構建 042
一、目的基因獲取 042
二、限制性內(nèi)切酶酶切 046
三、目的片段和載體連接 048
四、重組子轉化 050
五、重組載體篩選 052
六、重組載體鑒定 052
第二節(jié) 病毒載體構建 056
一、桿狀病毒表達載體 056
二、慢病毒載體 057
三、腺病毒載體 059
四、逆轉錄病毒載體 060
參考文獻 061
第三章 目的基因導入 065
第一節(jié) 動物細胞轉染 066
一、脂質體轉染 066
二、聚乙烯亞胺轉染 067
三、電穿孔轉染 068
四、影響細胞轉染的因素 069
第二節(jié) 細胞轉染效率檢測 070
一、流式細胞儀檢測 071
二、熒光顯微鏡檢測 071
參考文獻 072
第四章 重組穩(wěn)定細胞株篩選和評估 075
第一節(jié) 重組穩(wěn)定細胞池篩選 076
一、常用的抗生素篩選標記 076
二、遺傳霉素篩選 078
三、DHFR篩選 079
四、GS篩選 080
第二節(jié) 重組單克隆細胞株分離 081
一、有限稀釋法 081
二、流式細胞熒光分選技術 082
三、ClonePix 083
四、克隆環(huán)法 084
五、其他篩選方法 085
第三節(jié) 重組穩(wěn)定細胞系評估 086
一、細胞污染檢測 086
二、細胞系鑒定 087
三、外源基因整合分析 089
四、重組蛋白表達分析 098
參考文獻 101
第五章 重組蛋白分離純化 103
第一節(jié) 重組蛋白純化策略及設備 104
一、重組蛋白純化策略 104
二、重組蛋白純化設備 107
第二節(jié) 重組蛋白沉淀和膜分離技術 116
一、蛋白質沉淀法 117
二、膜分離技術 118
第三節(jié) 重組蛋白分離色譜技術 119
一、親和色譜法 120
二、疏水色譜法 122
三、凝膠過濾色譜法 124
四、離子交換色譜法 126
五、反相色譜法 129
參考文獻 131
第六章 重組蛋白藥物鑒定與分析 135
第一節(jié) 蛋白質理化特性 136
一、分子量測定 136
二、等電點與電荷異質性分析 141
三、肽圖分析 144
四、氨基酸組成分析 145
五、N端氨基酸測序 150
六、C端氨基酸測序 152
七、二硫鍵分析 153
八、高級結構分析 155
第二節(jié) 蛋白質含量分析 159
一、凱氏定氮法 159
二、Lowry法 161
三、BCA法 162
四、Bradford法 164
五、紫外吸收法 166
六、高效液相色譜法 166
第三節(jié) 蛋白質純度分析 168
一、宿主細胞蛋白殘留分析 168
二、宿主細胞DNA殘留分析 170
三、殘留抗生素檢測 172
四、其他成分檢測 173
第四節(jié) 糖基化修飾分析 181
一、分離富集親和技術 182
二、糖蛋白鑒定/糖基化位點的確定方法 187
三、糖鏈結構分析 189
第五節(jié) 生物學活性測定 206
一、體外法評估 207
二、體內(nèi)法評估 211
第六節(jié) 免疫化學特性分析 213
一、親和力測定 213
二、抗原結合表位測定 217
參考文獻 219
第七章 重組蛋白藥物新技術 223
第一節(jié) 人工智能與蛋白藥物設計 224
一、核苷酸及蛋白質相關數(shù)據(jù)庫 224
二、基因信息分析及密碼子優(yōu)化 226
三、蛋白質信息分析及結構預測 241
四、人工智能設計 255
第二節(jié) miRNA篩選與應用 269
一、miRNA篩選 269
二、miRNA應用 273
第三節(jié) 基因編輯技術 279
一、動物細胞CRISPR基因敲除 279
二、動物細胞基因敲入 289
第四節(jié) 表觀遺傳學技術 299
一、DNA甲基化分析 299
二、組蛋白修飾分析 305
三、非編碼RNA分析 314
第五節(jié) DNA與蛋白質相互作用分析 323
一、凝膠遷移實驗 323
二、DNaseⅠ足跡實驗 330
三、酵母單雜交系統(tǒng) 337
四、染色質免疫沉淀 351
五、噬菌體展示技術（DNA與蛋白質相互作用） 354
參考文獻 356
附錄1 常用緩沖液及試劑的配制 363
附錄2 中英文詞匯表 369
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