實(shí)驗(yàn)十七 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
　　（ELISA）——間接法
　　酶標(biāo)記免疫技術(shù)是一種免疫學(xué)檢測(cè)方法。其原理是利用抗原抗體反應(yīng)具有特異性，抗原或抗體吸附到固相載體表面，以及抗原抗體與酶連接后，仍保持免疫活性和酶活性，當(dāng)酶遇到相應(yīng)底物時(shí)，能催化其水解、氧化及還原等反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物。本法的特異性及靈敏度與熒光及同位素標(biāo)記相似，但其方法較以上兩者簡便，且不需特殊貴重儀器。因此，這項(xiàng)技術(shù)目前正越來越廣泛地被應(yīng)用到醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域中�，F(xiàn)以檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核患者血清中抗結(jié)核桿菌IgG抗體為例介紹ELISA間接法。
　　材料
　　1．聚合OT抗原（或PPD）。
　　2．待測(cè)病人血清、陽性及陰性對(duì)照血清。
　　3．辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG抗體。
　　4．O．05mol／L pH9．6碳酸鹽緩沖液。
　　pH7．4吐溫-磷酸鹽緩沖液。
　　pH5．0磷酸鹽．枸櫞酸緩沖液。
　　鄰苯二胺、30％雙氧水、2mol／L硫酸。
　　5．聚苯乙烯微量塑料板。
　　方法
　　1．包被抗原：抗原用O．05mol\pH9．6碳酸鹽緩沖液以最適濃度稀釋后，加入聚苯乙烯微量塑料板孔中，每孔100tM，置37℃過夜。倒空包被液后用pH7．4吐溫一磷酸鹽緩沖液洗三次，每次3分鐘。
　　2．加待檢血清：用pH7．4吐溫一磷酸鹽緩沖液作1：100稀釋，每孔加人100ul。每份標(biāo)本加2孔，每板設(shè)陽性及陰性對(duì)照血清，陽性及陰性對(duì)照血清均按1：100稀釋。置室溫2小時(shí)（或37℃ 40分鐘）后，倒空液體，用pH7．4吐溫一磷酸鹽緩沖液洗三次，每次5分鐘。
　　3．加酶聯(lián)羊抗人IgG：每孔加入適當(dāng)工作濃度的酶聯(lián)羊抗人．IgGl00tA，置室溫2小時(shí)（或37℃30分鐘）。倒空液體后如上洗三次。
　　4．加底物：每孔加入新鮮配制的底物（100mlpH5．0磷酸鹽-枸櫞酸緩沖液加鄰苯二40rag，30％H2O2 0．2ml）溶液100ul，放37℃顯色數(shù)分鐘，適時(shí)觀察顏色的變化，最后每孔加一滴2mol幾H，S04終止反應(yīng)，肉眼觀察或用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定各孔光密度。
　　結(jié)果判斷
　　肉眼觀察，陰性血清無色或微黃色。陽性血清明顯黃色。待測(cè)標(biāo)本明顯高于陰性而呈黃色則可判斷陽性。如測(cè)定光密度。
　　結(jié)果判斷
　　肉眼觀察，陰性血清無色或微黃色。陽性血清明顯黃色。待測(cè)標(biāo)本明顯高于陰性而呈黃色則可判斷陽性。如測(cè)定光密度，待測(cè)樣品光密度為陰性血清光密度值的2倍以上可判為陽性。
　　注意事項(xiàng)
　　1．包被液通常用pH9.6碳酸鹽緩沖液，包被時(shí)間不少于18h，包被板一經(jīng)洗滌，則不宜存放過長時(shí)間。
　　2．包被和溫育均應(yīng)將固相載體放至濕盒內(nèi)進(jìn)行。
　　3．洗板一定要力求洗得干凈，以保證實(shí)驗(yàn)成功。
　　思考題
　　為什么標(biāo)記一種抗抗體可以檢測(cè)多對(duì)抗原抗體系統(tǒng)?
　　實(shí)驗(yàn)十八 免疫熒光技術(shù)——間接法
　　免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體法。熒光素是一種經(jīng)紫外光照射后能激發(fā)熒光的染料（常用的有異硫氰酸熒光素和羅丹明等）。熒光素能與抗體球蛋白結(jié)合，而又不影響抗體活性。由熒光素標(biāo)記的抗體（熒光抗體）與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗原結(jié)合后，即可在熒光顯微鏡下觀察到綠色或橙黃色的熒光。
　　材料
　　1．抗原：待測(cè)病人血液標(biāo)本。
　　2．免疫血清：抗鉤端螺旋體的特異性免疫血清。
　　3．熒光標(biāo)記羊抗人抗體（抗抗體）。
　　4．其他：熒光顯微鏡、載玻片、潮濕容器等。
　　方法
　　1．制片：取早期鉤端螺旋體（簡稱鉤體）病人靜脈或耳垂血1滴，置于清潔玻片上推成血膜，自然干燥，火焰固定；或取早期病人血液2ml制成血漿，加鉀明礬（0．05g／ml），置室溫15分鐘，以2 500r／min離心30分鐘，取沉淀做涂片，晾干，用95％乙醇固定；或取疑為鉤端螺旋體病人靜脈血1ml，加于盛2ml枸櫞酸鈉鹽水的試管中，混勻，差速離心，取沉淀做涂片。晾干，火焰或丙酮固定。
　　2．加免疫血清（抗體）：將已固定的標(biāo)本片上加1：50稀釋的未標(biāo)記的抗鉤端螺旋體特異性免疫血清覆蓋，置37℃ 30分鐘，經(jīng)水洗，待干燥。
　　3．加熒光抗體（抗抗體），37℃作用30分鐘，水洗，干燥。
　　結(jié)果判斷
　　熒光顯微鏡檢查：在熒光顯微鏡下可觀察到培養(yǎng)物及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)感染標(biāo)本中的鉤端螺旋體，有明顯的綠色熒光，菌體較長，常呈C或S型，兩端或一端有鉤。
　　病人血清中的鉤體，多數(shù)不典型，表現(xiàn)為菌體短小，體表整齊，有2～3個(gè)螺旋，鉤亦少見。
　　注意事項(xiàng)
　　1．每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)做對(duì)照（用PBS代替一抗、二抗）板以排除非特異性熒光。
　　2．溫育時(shí)一定要將玻片放在濕盒中，以防液體蒸發(fā)。
　　思考題
　　試述免疫熒光技術(shù)的原理以及它的種類。